动物造模,药效评价 z-bio 2024-08-22 226

　　(1)模型方法  成年大鼠，按100mg/kg体重的剂量腹腔注射乙醚或氯胺酮麻醉，仰卧固定，沿上腹部横切口开腹，电凝器将腹壁血管烧灼止血。暴露肝脏，切断镰状韧带、冠状韧带和叶间韧带，显露肝门，先结扎切断门静脉头支腹侧胆管，暴露出门静脉头支和伴行肝动脉，用5-0丝线结扎门静脉头支和伴行肝动脉。然后仔细分离出门静脉右支进入右上、下叶的分支和伴行肝动脉，并用5-0丝线结扎门静脉右支或其右上叶的分支。此时可见被结扎的肝叶呈缺血状态。用5.5号针头在结扎线上方分别刺入门静脉，注入5％葡萄糖氯化钠溶液10ml/kg体重，或乳酸钠林格氏液至肝叶色泽变白，然后迅速用5-0丝线结扎，切除肝叶。共切除85％～95％肝组织。检查无出血后缝合腹壁切口。术后观察大鼠精神状态、活动情况、肝功能改变和12h生存率。术后大鼠以苏醒翻身活动为手术成功的标志，不能苏醒翻身立起及12h内死亡者被认为是手术操作失败。或健康小猪，经腹腔注射巴比妥钠30mg/kg体重麻醉，右上肢建立输液通道，鼻导管吸氧，仰卧固定，按上腹正中切口逐层进腹，游离门静脉及右肾静脉。门静脉内注入0.25mg肝素，取充满2％肝素生理盐水的硅塑管(长15cm、直径0.8cm)，于游离右肾静脉远端向心插管至下腔静脉内2～3cm并固定，另一端自门静脉近心端向远心端插入1.5cm左右并固定，随即开放转流管，检查无明显出血后关腹。2d后行二期手术，进腹后切断所有的肝周韧带(包括左右三角韧带，冠状韧带，镰状韧带及肝胃韧带)，缝扎肝动脉的向肝分支，最后结扎肝动脉和胃十二指肠动脉，造成人肝血流完全阻断，行股动脉插管监测血压。在入肝血流完全阻断后1、4、7h，摘取小块肝组织分别用10％甲醛和0.25％戊二醛固定。然后关腹。术中给实验猪静脉输入平衡盐水500ml，青霉素80万U，死亡后尸解，留取肝脏标本待检。造模过程中，可动态观察模型动物的一般状况、死亡时间，同时，抽取全血制备血清作生化检测。造模毕，处死动物摘取肝脏作组织形态学检查。

　　(2)模型特点  大鼠术后苏醒很快，能翻身活动，但1～2h后即出现肝衰竭表现，12h后相继出现肝昏迷，表现为精神萎靡，身体蜷缩，鼠毛竖立，活动减少，拒饮拒食，尿色发黄。行85％肝组织切除的模型动物12h存活率为93％，48h全部死亡；行95％肝组织切除的模型动物2, 4, 6, 12h存活率分别为92％、75％、58％、50％，24h全部死亡。模型小猪在人肝血流完全阻断后12～16h内死亡。术后12h，大鼠丙氨酸转氨酶(ALT)、血氨(NH3)、总胆红素(TBIL)水平升高，血糖(GLU)水平降低。模型小猪在入肝血流阻断后，丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、Amm、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、凝血酶原时间(PT)呈进行性升高，白蛋白(ALB)、纤维蛋白原(FIB)进行性降低。大鼠术后12h处死时，残余肝脏组织色泽暗红，包膜肿胀，表面渗血。镜下可见肝小叶结构破坏，肝细胞大片变性坏死，胞质疏松，坏死区炎症细胞浸润，肝窦扩张，呈网眼状，可见淤血和出血。模型小猪入肝血流完全阻断1h后，肝小叶结构和肝细胞排列尚属正常，狄氏间隙稍扩张，肝细胞混浊肿胀，但核膜、核仁尚清楚；4h后光镜下可见肝小叶结构尚存在，肝细胞排列尚未紊乱，肝板结构存在，狱氏间隙明显扩大，中央静脉塌陷，肝细胞浆内空泡样变性，细胞核固缩，核仁消失；电镜下可见细胞浆内糖原颗粒均质化，粗面内质网脱颗粒，线粒体水肿，嵴模糊，部分线粒体溶解，细胞间毛细胆管微绒毛明显减少，细胞核染色质集聚，核变形，核内假包涵体形成。7h后镜下示肝小叶结构紊乱，肝细胞排列紊乱，肝板离解，狄氏间隙扩张更加明显，肝细胞浆中的混浊肿胀和空泡变性更加显著，核染色质边集，部分肝细胞膜不完整且有开始溶解坏死的迹象。在因肝衰竭导致死亡并即刻进行肝组织镜检时发现，模型猪肝小叶结构辨认不清，肝细胞减少，排列紊乱，肝板离解，狄氏间隙扩张，可见灶状和点片状广泛肝细胞坏死。

　　(3)比较医学  急性肝衰竭是由多种因素导致的弥漫性肝细胞坏死和/或突发的肝功能严重损害的综合征，患者的病死率可高达75％以上。其病因主要由肝炎病毒引起，也可由一次性或反复的外伤、过量的药物或毒物所致。目前，急性肝衰竭动物模型主要有外科手术和药物毒物肝损伤两大类，其中，全肝或部分肝切除是最经典也是较常用的造模方法。全肝切除无疑可导致肝衰竭，但这种模型所表现的特征与临床急性肝衰竭的病理过程相差甚远，如病程的不可逆，肝昏迷时间短，循环中不存在损伤或死亡的肝细胞和由此不断释放的毒性物质，肝功能的异常仅在模型动物死亡前2～4h才会有所表现。鉴于这些不足，人们研究并建立了部分肝切除急性肝衰竭动物模型取而代之。在正常情况下，当肝脏功能正常时，动物可以耐受70％～75％以下的肝切除，若肝切除超过75％将会发生致命性肝衰，当肝脏切除超过85％以上时需加作门一腔分流，而且动物近乎100％在48h内死亡。本模型行部分肝切除术，切除肝脏组织85％～95％，术后6～12h，动物肝肾功能表现异常，呈进行性加重，并相继出现肝昏迷，组织形态学检查显示，肝小叶结构紊乱，肝细胞减少，肝板离解，狄氏间隙扩张明显，可见灶状和点片状广泛肝细胞坏死，动物在术后24～48h内全部死亡。部分肝切除相对全肝切除模型，其生理病理特征更接近于临床，且有逆转的可能。如对于90％肝切除大鼠，术前连续3d给予肝细胞脾内移植，40％模型的存活期可超过28d。至今，人们已成功复制建立了多种动物部分肝切除模型，如大鼠、兔、犬和猪。其中，小动物模型比较适用于研究急性肝衰竭的病理生理过程及药物干扰对该过程的影响，而大动物模型更习惯用于评价人工肝技术的疗效和安全性。肝大部切除法肝衰竭动物模型具有其独特的优点，复制周期短，肝脏切除可量化，剩余肝组织无特异性病理改变，动物症状及相关血液指标变化符合肝衰竭临床表现，模型重复性和稳定性较好，成功率高。