动物造模,药效评价,萎缩性胃炎 z-bio 2024-08-21 223

　　(1)复制方法

　　1)小鼠模型：BALB/c小鼠，SPF级，6～8周龄。禁食12h禁水8h后接种Hp(SS1)培养悬液1000000000000CFU/L，隔天1次，共3次，每次100μl。Hp(SS1)培养悬液制备方法：Hp(SS1)菌株接种在含10％羊血及多种抗生素(10μg/ml万古霉素、3μg/ml多黏菌素、5μg/ml二性霉素B、5μg/ml磺胺增效剂)的Burcella肉汤琼脂培养基上，37℃、5％O2、10％ CO2、85％N2条件下培养48h，然后用PBS将其洗下，选取动力检测合格者。在接种Hp 12周及24周时，断颈处死，剖腹取胃，沿胃大弯剪开，用PBS洗去胃内容物，沿胃小弯剪取从食管到十二指肠球部的组织，10％甲醛固定，石蜡包埋，5μm切片，HE染色观察炎症反应，Giemsa染色观察Hp定植情况。

　　2)大鼠模型：Wistar幼年大鼠，体重为110～130g，禁食12h后用5％Na2HCO3溶液2ml/只灌胃，15min后给1000000000000CFU/L Hp(S67和s73)混合菌株2ml/只。每周感染1次，供4次。末次感染1周后，急性处死动物，开腹取胃，沿胃大弯剪开，用PBS洗去胃内容物，在幽门端相对固定部位取5块组织，供直接涂片、尿素酶试验和Hp培养，其余胃体用10％甲醛固定，作组织病理学检查。

　　3)蒙古沙鼠模型：蒙古沙鼠(Mongoliangerbil，MG)，8周龄，禁食禁水12h后灌胃给50％乙醇0.3ml/只，之后继续禁食禁水，次日灌胃给1000000000000CFU/L Hp菌液0.5ml/只，上、下午各1次，隔日上午再灌胃1次，12周时造模毕。模型动物处死前断食断水24h，临处死前眼球放血，分离血清， ELISA检测抗Hp抗体，处死后开腹取胃，沿胃大弯剪开，用生理盐水轻轻洗去胃内残留物，肉眼观察胃黏膜大体情况，然后一半黏膜组织进行培养、涂片及快速尿素酶纸片试验，另一半黏膜组织用10％甲醛固定，作组织病理学检查。

　　4)小型猪模型：足月妊娠中国1号小型母猪出现分娩先兆后，于手术间内剖腹取胎，将乳猪置于无菌隔离器内饲养，给予无菌牛奶，自由采食。10d时口服给消炎痛12.5mg/只，1次/d，连续3d，第4日时口服给1000000000000CFU/L Hp菌液2ml/只，1次/3d，共3次。然后，将动物转置于实验动物二级环境中饲养，在给Hp后30d时将其处死，分别摘取食管、胃体、胃窦、十二指肠黏膜标本做组织切片HE染色，观察组织学改变，并行尿素酶法检测Hp菌、Warthin- Starry银染色找Hp菌、微需氧法培养Hp菌。

　　(2)模型特点  模型小鼠感染12周时，胃组织表面的黏液及胃小凹顶部胃组织可见大量Hp定植，尤以胃体一胃窦及胃体一胃底交界处的定植密度最高，24周时，Hp定植密度增加；胃组织除出现萎缩(腺体扭曲及结构异常)、胃上皮细胞变性外，尤以炎症细胞浸润为其典型特点；感染12周时，炎症细胞浸润以多核淋巴细胞为主，24周时，还出现中性粒细胞及嗜酸性粒细胞浸润。模型MG感染4周时，便可测出 Hp感染阳性，12、24周时，感染率达到100％；巨检可见胃组织黏膜有明显出血、慢性活动性胃炎及溃疡等病变，有时溃疡可深达肌层；镜下检查显示，感染4周时，动物胃窦及幽门部胃黏膜上皮细胞、腺窝上皮细胞间及固有层中出现大量炎症细胞，包括中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞，黏膜下层血管扩张、充血明显，腺体萎缩并伴有上皮细胞变性及坏死。随着时间的推移，炎症细胞浸润加重，逐渐形成以淋巴细胞聚集为主的淋巴滤泡。在胃窦、幽门部及胃体部黏膜上皮细胞表层黏液、胃腺窝中以及上皮细胞间可明显见到大量Hp存在。模型小型猪感染30d时，胃黏膜表面稍显增厚和水肿，食管、胃、十二指肠黏膜内有程度不等的浅表黏膜糜烂和炎性渗出，固有层内有炎症细胞浸润，部分可见淋巴滤泡增生，呈慢性活动性胃炎的病理特征。细菌学检查显示，在其食管、胃体、胃窦、十二指肠、小肠、大肠黏膜处Hp感染全部呈阳性反应，Warthin-Starry银染色可见在胃体、胃窦黏膜表面有大量的杆状或S形被染为黑色的Hp菌，部分病灶可见堆积的Hp，食管黏膜、十二指肠黏膜亦可见到清晰被染为黑褐色的Hp。

　　(3)比较医学  大量流行病学资料证实，Hp是引起包括慢性萎缩性胃炎在内的非糜烂性胃炎的主要原因。Hp是一螺旋状，革兰染色阴性的微生物，可引起绝大多数的非糜烂性胃炎及其并发症。人类感染该菌体后即可引起胃黏膜炎症，从而影响胃的分泌机制。使胃黏膜对酸的损伤更敏感。对此，研究人员近年来一直在尝试采用各种手段用Hp感染不同的动物，拟建立一种类似人类的由Hp感染诱导的慢性萎缩性胃炎动物模型，并订立了洛爽标准。该标准要求：①胃黏膜上可看到Hp定植，在胃体、胃窦出现类似人类的病理学改变。②每克胃组织有一定数量Hp。③要观察到Hp和胃黏膜黏附。④要有细菌长期、持续感染。⑤采用的菌株，须是经体外一定次数传代培养后仍能感染动物的稳定菌株。按照该标准，研究人员先后用Hp感染并成功诱导了小鼠、大鼠、蒙古沙鼠、犬和猪的慢性胃炎动物模型。但对大多数动物而言，Hp定植率低、感染维持时间短始终是影响其造模成功率的难以逾越的技术障碍，所以挑选对Hp的易感动物和筛选动力强的Hp菌株是其技术关键。如：Hp(SS1)是一株通过在小鼠胃内连续传代、分离出的适合在小鼠胃内定植的菌株。该菌株动力极强，含有cagA、vagA，属I型Hp。流行病学调查显示，I型Hp与消化性溃疡的发生关系密切，其内含有致病岛(Pathogenicity Island)，表达vacA，空泡毒作用阳性。用该菌株接种于SPF级的BABA/c小鼠胃内，能引起动物胃组织严重的病理改变，包括正常胃腺体消失、糜烂及溃疡等，造模成功率为100％。而大鼠与小鼠比，在无胃黏膜损伤情况下，很难发生Hp感染，一般须先造成大鼠胃黏膜损伤，然后再以Hp对之进行感染，故很少单纯采用Hp制备大鼠相关性慢性胃炎的模型。MG本身对Hp感染率很低，但预先皮下注射消炎痛20mg/kg体重或灌胃给50％乙醇5ml/kg体重，则感染率可提高到70％以上，且造成明显的胃炎模型。组织形态学表现为：3周内黏膜糜烂，黏膜层出现中性粒细胞和单核细胞浸润，6周时黏膜固有层和黏膜下层出现淋巴滤泡，12～24周时出现萎缩、肠化和溃疡。值得一提的是，Hp感染MG后可长期持续定植于胃，主要存在于胃表面黏液层中，少数黏附于表层黏液细胞表面。MG胃中菌量可达100000CFU，引起的病变主要在胃窦，类似于人类。对照洛爽标准，除③不甚典型外，其他均符合该标准。除上述动物感染Hp获得成功外，国外用悉生狗、悉生猪、无特定病原猪等动物复制Hp感染模型也已获得成功。由于猪是杂食性动物，猪胃解剖结构、生理功能和饮食习惯与人有非常相似之处，因此选用猪作为实验动物有其合理的一面。但由于该模型复制技术复杂，环境要求高，造模价格昂贵，所以很少见有实际应用者。在此背景下，有研究者尝试先在悉生条件下建立Hp感染，然后将动物在普通条件下饲养，结果Hp仍能持续存在，从而较好地解决了采用悉生猪全程试验所必然遇到的难以承受的技术和价格等瓶颈问题。实验表明，感染Hp后，模型动物首先在贲门的非腺体部位引起短暂的和不连贯的中性粒细胞浸润，继之在胃内腺体部位引起淋巴细胞浸润；淋巴细胞开始仅在黏膜下层和黏膜层聚集，然后发展到黏膜下层和固有层形成不连贯的淋巴滤泡。胃黏膜组织的Warthin-Starry银染色发现Hp位于胃黏膜上皮和表层黏液保护层之间，这一点与Hp在人胃内的表现相似。复制中国1号小型猪Hp模型的技术关键主要在于在Hp接种前先经口给予非甾体药物消炎痛进行预处理。由于胃肠道内特别是胃黏膜层内含有大量的前列腺素(PG)，后者对胃肠道的生理功能具有广泛的调节作用，包括影响胃黏液的分泌，调节胃黏膜的血流，保护黏膜的屏障作用。而消炎痛在体内能够抑制前列腺素(PG)合成。当将消炎痛摄入体内，导致体内特别是胃黏膜内的PG含量明显下降，因此直接损伤了胃黏膜的屏障功能，也就降低了上皮细胞的保护功能，从而为Hp定居在胃黏膜内创造了合适的条件。