动物造模,药效评价,葡萄膜炎 z-bio 2024-08-09 240

　　1．模型制作方法  Wistar大鼠，体重200g左右。

　　(1)内毒素的制备：霍乱弧菌18 001株，古典生物型，小川血清型。①将经过鉴定的纯化霍乱弧菌种先从厚氏大管斜面传于厚氏肉汤培养基中，37℃过夜培养。第2天，将厚氏扁平培养物扩大培养至20瓶，37℃培养4h以上，待pH稳定后，加甲醛灭活，离心收获细菌。置于一20℃保存。②LPs的分离、纯化LPS的分离纯化参照West2phal和Jann的酚水法提取细菌脂多糖步骤进行。取200g灭活菌体，加入无热原双蒸水(PFW)搅拌使其成菌悬液。加入等体积90％(W／W)重蒸苯酚(事先预热至68℃，pH调至7～10)，此时混合液菌体浓度达到每克菌体20ml混合液。混合液在冰浴中搅拌30min，然后将此混合液在冰浴中冷却(不断搅拌)至10℃左右。再以7 300g，10℃离心1h，小心移取上相液体，将中间层和下层液合并并测量总体积，加入PFW至原混合液总体积，再重复抽提1次。将2次上相合并，加入乙醇使其终浓度为25％(V／V)，同时加NaAc(终浓度10mmol／L)，CaCl2(终浓度1mmol／L)于3～8℃静置过夜，第3天以7 300g离心1h，收集沉淀即为粗制LPS。将此粗提物用200ml 50mmol／L Tris-HCl(pH7.2)缓冲液悬浮，加入透析袋(Mwco=12 000)在50mmol／L Tris-HCl(pH7.2)的缓冲液中平衡至37℃，然后向透析袋中加入50mg RNase和50mg DNase I，并更换透析液，37℃搅拌透析液6h。再向透析袋中加入100mg蛋白酶K，并更换透析液，37℃搅拌透析液24h。然后在PFW中4℃条件下透析2d，每天更换透析液2次。吸出透析物以64 000 g，3～8℃离心5h，弃上清，用PFW悬浮沉淀，再加入等体积90％(V／V)重蒸酚(pH7.0预热至68℃)重新抽提1次(方法同前述)。小心移取抽提后离心所得上清液，于3～8℃在PFW中透析2d。取出透析物，于190～340nm波长范围内紫外光扫描分析其浓度，真空冷冻干燥后，保存T-20℃。③LPS的配制。用无菌生理盐水稀释LPS为16g／L，一组注射液配方为，13μl稀释液+500μl PBS+500μl完全福氏佐剂；一组为13μl稀释液+400μl PBS+5μl百日咳原液。

　　(2)动物致敏：健康成年Wistar大鼠于1周前用200g／kg液体石蜡按每只1ml腹部皮下注射致敏。取无异常反应者用于LPS注射。

　　(3)注射LPS于已致敏大鼠，于上述LPS的第1种配方用于足垫部的注射，1只0.4ml，第2种配方用于腹腔注射，1只0.15ml。

　　2．观察指标与分析

　　(1)眼部症状：LPS注射虹膜血管扩张充血严重，前房角粘连；脉络膜血管增生，并有弥漫性血细胞浸润，其间可见白细胞增多，局部水肿而皱褶；视网膜与脉络膜脱离，局部水肿增生，视网膜色素层色素上皮细胞增生；视网膜局部蛋白样渗出并累及与其紧连的节细胞层，纤维层被渗出物所掩盖或趋于缺失。蛋白样渗出物呈现不均一性，与其相连的节细胞层细胞排列紊乱，血管壁及其附近组织有纤维化发生；局部纤维层的纤维丛集成束团状，遍布其间，有的发生严重纤维化，同时可见其间的血管内有血栓样物形成。系列临床可见的炎症反应，其症状与葡萄膜炎一致。4h时，可见虹膜血管扩张淤血；8h时，角膜水肿，前房混浊，Thydull征(+)，有少量渗出，血管仍充血，虹膜水肿加重，范围扩大；12h时反应达到最重，虹膜高度水肿，血管扩张充血严重，渗出可见，前房积血，并可见前房有絮状物漂浮，Thydull征(+)，瞳孔缩小；24h时，上述症状减轻。

　　(2)病理检查：可见角膜上皮水肿，角膜基质排列较松散，睫状体血管增多充血并可见蛋白样渗出，虹膜血管扩张充血严重，前房角粘连；脉络膜血管增生，并有弥漫性血细胞浸润，其间可见白细胞增多，局部水肿而皱褶；视网膜与脉络膜脱离，局部水肿增生，视网膜色素层色素上皮细胞增生；视网膜局部蛋白样渗出并累及与其紧连的节细胞层，纤维层被渗出物所掩盖或趋于缺失。蛋白样渗出物呈现不均一性，与其相连的节细胞层细胞排列紊乱，血管壁及其附近组织有纤维化发生；局部纤维层的纤维丛集成束团状，遍布其间有的发生严重纤维化，同时可见其间的血管内有血栓样物形成。另外在切片中还可以明显看到视网膜中血管的扩张充血，特别是内核层和外网层中毛细血管的扩张，以及视盘部视网膜主动脉管壁周围有大量纤维包绕，紧连的视网膜部分出现增生或肿大，纤维层纤维化。