动物造模,药效评价,肝癌转基因 z-bio 2024-08-09 101

　　建立肝癌转基因动物模型的实验动物多选用CD1、 C57BL/6×DBA、C57BL/6×SJL等品系小鼠。转入动物体内的外源性基因可为HBx，SV40，C-myc等单基因，也可为 c-myc/TGF-α，C-myc/TGF-β1，HBx/c-myc等双基因。转入单基因建立的肝癌动物模型比转入双基因建立的肝癌动物模型的操作步骤简单，建模成功率高，但转入双基因建立的动物模型实验周期要短于转入单基因建立的动物模型。

　　1.乙型肝炎病毒(I-IBV)转基因动物模型  在原发性肝癌中最多见的是肝细胞肝癌，而在肝细胞肝癌中90％与病毒性肝炎有关。HBV一般不感染培养的细胞也不感染常用的实验动物，因而在一定程度上限制了对其致肝癌机制的研究。转基因肝癌动物模型为研究肝炎病毒相关性肝癌提供了新的途径和方法。目前国外学者在此方面进行了较多地研究和报道。

　　复制方法：将1.15kbHBV亚型adr DNA片段通过显微注射法转入CD1小鼠单细胞受精卵，使其整合于宿主基因组中，分析小鼠不同组织HBx转基因RNA的表达水平。或将0.87kbHBV亚型adr DNA片段(位于基因组的988～1860核苷酸位置)导入pUC118载体，通过显微注射法将 DNA片断转入雌性(C57BL/6×DBA)F1代小鼠的受精卵细胞核内，再将其转入假孕的雌性小鼠，分析小鼠不同组织 HBx转基因RNA的表达水平。Kim等在CD1小鼠上建立了HBx转基因小鼠肝癌模型，发现HBx转基因RNA在肝、肾和睾丸组织中有相对高水平表达，这种HBV DNA序列在肝和肾组织中的选择性表达与感染HBV的人体情况相同。肝脏组织学检查发现：4月龄时出现肝细胞异常改变的多病灶区，胆细胞增殖程度无明显增加。8～10月龄时，肝脏出现肿瘤结节，具有肝细胞腺瘤的特点，结节内肝细胞HBx蛋白处于高水平表达，同时检测甲胎蛋白(AFP)呈阳性。该转基因小鼠的生存期在性别上存在差异，大部分的雄性转基因小鼠死亡时间在11～15月龄，而雌性小鼠在17～21月龄才出现死亡。解剖分析发现，所有动物的肝脏均出现肿瘤，镜下病理组织学诊断为肝细胞癌。癌组织仍有HBx蛋白和 AFP的高表达，部分动物出现肝癌转移。该模型的肝肿瘤发生情况存在明显的性别差异，肝癌发病率分别为雄性小鼠90％，雌性小鼠60％。Yu等应用C57BL/6×DBA小鼠建立了HBx转基因小鼠肝癌模型，研究发现：6月龄时肝脏出现不典型增生，11～18月龄时发展为肝细胞癌，该模型的肿瘤发生率为86％。检测HBx表达情况发现：HBx蛋白在非转基因鼠肝细胞中不表达，在转基因鼠发育不良及不典型增生的肝细胞中呈高表达；在非转基因鼠肝组织中未检出增生细胞核抗原(PCNA)阳性细胞，而转基因鼠不典型增生肝结节和肝细胞癌组织的PCNA阳性细胞数显著增加，说明HBx抗原作为HBV编码的病毒反式激活因子，启动了肝癌的形成，与肝癌的发生有明显的相关性。

　　2.猴病毒40(SV40)转基因动物模型  不同启动子的猴病毒40(SV40)转基因动物可以发生不同部位的细胞异常，如胰岛素基因启动子调节下的SV40基因引起胰腺癌，抗凝血酶Ⅲ(antithrombin Ⅲ，ATⅢ)基因增强子调节下SV40T基因可引起肝癌。

　　复制方法：利用人ATⅢ基因和SV40T抗原(SV40- Tags)序列构建外源DNA，建立了SV40转基因小鼠肝癌模型。Gillet等研究发现，2月龄以前肝脏出现有丝分裂异常，4月龄时出现许多界限分明的肿瘤小结节，6月龄时发展为肝细胞腺瘤，并在结节周围出现发育不良的肝细胞。与人体的肝细胞腺瘤不同，该模型没有表现出任何肝硬化的征象。7月龄为肝癌发展的晚期，其肝重可为正常肝脏的15倍，肝脏结构被完全破坏，同时伴有许多坏死区。这些转基因小鼠的生存期很少越过10个月，大部分在8月龄时死亡，其肿瘤发生率为100％，与其他转基因肝癌动物模型不同的是，该模型的部分动物出现了肺转移，说明AT-SV40T转基因诱导的肿瘤恶性程度较高。分析转基因的表达水平，发现Tag- mRNA的表达在出生时很低，1周后急剧上升，而且仅局限于肝脏，增生结节内转基因的mRNA和蛋白表达水平高于非增生区。在肝癌晚期，肝病变区内的表达水平明显降低，但肺转移肿瘤表达水平显著提高。鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)作为肝分化的敏感标志物，7月龄以前在肿瘤结节和周围细胞中可检测到其mRNA表达，随后表达水平下降，但在肺转移肿瘤中仍有明显表达。Dupuy等建立了SV40转基因小鼠肝癌模型来研究肿瘤血管生成和组织因子表达情况。研究发现：肝癌中有明显异常的血管生成，在腺瘤阶段，即有肝窦状隙的增殖、改造和动脉化；在有些窦状隙，可发现具有内皮细胞显型的肝细胞植入内皮细胞中，提示了局部血管生成的模式通过这个转基因模型发现这些异常的血管生成主要与血小板活化有关，并发现这种血小板的活化是被内皮细胞和侵袭性巨噬细胞产生的组织因子(TF)所激活，HIF-1a/VEGF、TF在肝癌血管生成中均起关键性作用。此模型可作为抗肿瘤血管生成或抗肿瘤血栓生成等药物的筛选模型。

　　3.转化生长因子旺(TGF-a)与c-myc双转入的转基因小鼠肝癌模型  原癌基因TGF-a和C-myc经常共同表达于人原发性肝癌组织，表明他们之间的相互作用可能是细胞恶性变的重要过程。与单独表达Alb-c-myc或MT- TGF-a转基因动物相比，这种双转入的c-myc和TGF-a基因在小鼠肝脏的同时表达会大大加快肝脏肿瘤形成。

　　复制方法：首先将构建的4.5kb Alb/c-myc基因转入(C57BL/6j×CBA/j)F1受精卵，培育Alb/c-myc转基因小鼠；再将构建的2.3kb EcoRI MT-TGF-a基因转入CD1受精卵，培育MT/TGF-a转基因小鼠；将两种转基因小鼠进行交配，获得TGF-a/c—myc转基因小鼠。研究表明：单独整合有Alb增强子/启动子的c-myc转基因小鼠在2月龄前表现出不同程度的肝细胞发育不良，12月龄时没有发现肝增生结节，15～18个月时部分动物出现肝细胞腺瘤。 MT/TGF-a转基因小鼠在10～15月龄时才能诱导产生多灶性分化良好的肝细胞癌。而TGF-a/c-myc转基因小鼠在6周龄时，肝细胞就出现明显的发育异常，表现为核仁密集、染色质浓缩等细胞凋亡的征象。到9周龄时，大约80％的转基因小鼠都出现这类损伤，并形成很多发育不良的细胞灶。19周龄以后，70％的转基因雄性小鼠肝脏出现单一或多灶性肿瘤结节，病理分析为分化良好的肝细胞癌。而在此阶段，c-myc或TGF-a转基因小鼠肝脏均无相应的病变损伤。在整个实验期内，相同月龄的(C57BL/6j×CBA/j)× CD1野生型(WT)小鼠肝脏未见肿瘤形成。