动物造模,药效评价,脑脊髓炎 z-bio 2024-08-07 68

　　(一)变态反应性脑脊髓炎豚鼠模型

　　方法一

　　1.造模材料  动物：豚鼠，体重400g左右，雌雄不限；药物：Freund佐剂，生理盐水；器械。

　　2.造模方法  脊髓-FA乳剂的制备：在无菌条件下将豚鼠肝素化，然后经胸主动脉用生理盐水灌洗至无血，取出脊髓，除去脊膜，称重，用玻璃匀浆器将脊髓研成匀浆，以生理盐水制成50％悬液；将脊髓组织悬液与FA按1：1混合，用注射器反复抽注，即成乳剂。

　　于豚鼠的4个足掌肉垫各注射脊髓-FA乳剂0.1ml，每只豚鼠共注射0.4ml，注射后常规饲养。

　　3.造模原理  自身免疫导致动物变态反应性脑脊髓炎。

　　4.造模后的变化  造模半个月后，血清中逐渐出现抗脊髓抗体，皮肤实验呈延缓反应，而且豚鼠陆续出现后肢瘫痪，甚至大、小便失禁，很易死亡。

　　方法二

　　1.造模材料  动物：大鼠，300～350g；豚鼠，雌雄各半，体重250～350g；药物：弗氏完全佐剂。

　　2.造模方法  碱性髓鞘蛋白(myelin basic protein, MBP)抗原制备：将大鼠处死后，迅速取出脊髓，用匀浆器制成50％的匀浆，与等量弗氏完全佐剂(卡介苗10mg/ml)混合，用注射器抽注至油包水乳剂。

　　用MBP抗原注入豚鼠后足掌皮下，每侧0.2ml制造变态反应性脑脊髓炎(experimen-tal allergic encephalomyelitis, EAE)模型。

　　3.造模原理  异种蛋白导致动物变态反应性脑脊髓炎。

　　4.造模后生化变化  模型组脑组织细胞因子IL-1β水平显著高于对照组[对照组(0.51±0.02)ng/mg，模型组(2.85±0.70)ng/mg]。

　　模型组脑组织细胞因子TNF-α水平显著高于对照组对照组[1.13±0.28)ng/mg，模型组(2.83±0.90)ng/mg]。

　　(二)SD大鼠实验性变态反应性脑脊髓炎模型

　　1.造模材料  动物：SD大鼠，10周龄，雌性，体重200～230g；药物：弗氏完全佐剂(complete freund adjuvant, CFA)。

　　2.造模方法  SD大鼠脊髓脑匀浆(SD spinal cord homogenate, SD-SCH)制备：用过量的10％水合氯醛腹腔注射SD大鼠致死，取脊髓及大脑称重。按1g大鼠脊髓及大脑白质加1ml磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution, PBS)的比例，在冰浴中用电动匀浆机(3000r/min)，将其匀浆3min(每匀浆1min，间隔1min)，制成大鼠脊髓脑匀浆。将该匀浆与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀制成诱导乳剂。

　　模型组大鼠双后足垫皮下注射诱导乳剂0.006ml/kg 2次，并于大鼠后足垫背面真皮内辅以注射0.2ml百日咳杆菌(2×10的10次方个菌体/ml)1次，正常对照组用PBS与CFA等量混合后注射。

　　3.造模原理  自身免疫导致动物变态反应性脑脊髓炎。

　　4.造模后的变化  模型组动物在致敏后第1、2天出现体重减轻，之后逐渐增加并于发病前趋于稳定。对照组观察70天未出现临床症状。模型组大鼠于发病前体重突然下降，随着临床症状的出现，体重下降程度和临床症状严重程度相一致；随着病情的缓解体重逐渐增加。其出现的临床症状主要表现为程度不等的食欲缺乏、活动减少、体重下降、尾巴无力、松弛、下垂；步履蹒跚、后肢无力、麻痹等，严重者可出现濒死状态，甚至死亡。模型组动物两次的发病持续时间分别为16～20天、10～14天；发病率为85％，复发率为46.67％，而致死率仅有5.88％。

　　5.造模后病理变化  模型组动物的病理改变主要表现为血管炎伴周围髓鞘脱失，主要病变包括：①血管“袖套样”改变，小血管尤其是小静脉周围有大量炎性细胞密集环绕而成，呈“袖套样”；②胶质细胞结节，可见多个由于胶质细胞增生而形成的结节；③脱髓鞘改变，髓鞘染色可见大小不等的片状脱髓鞘区；④神经元变性，尤其是脑干或脊髓的神经元胞体明显增加，形态圆顿，胞核偏位，核仁消失，尼氏体崩解为细胞颗粒状或完全消失，细胞质着色浅淡；⑤卫星现象，由胶质细胞和中性粒细胞围绕变性的神经元所形成的现象；⑥格子细胞，在炎性病灶内有大量格子细胞，它是由小胶质细胞增生，吞噬髓鞘的破坏产物类脂质和中性脂肪而形成。

　　模型大鼠病灶主要侵犯大脑及脊髓的白质以及灰白质交界处，皮质及皮髓质交界处甚至深部髓质，脑脊膜和侧脑室周围也被累及。病灶也侵犯小脑，脑干和视交叉，这与观察到的共济失调、抽搐等临床表现相一致。

　　电镜所见：病变散在分布，组织间隙尤其是小血管周围明显水肿，血管内皮细胞线粒体肿胀，紧密连接处模糊不清。血管腔外分布多个游走的淋巴细胞和单核细胞。实质内淋巴细胞细胞质增多并伸出突起，成为激活的淋巴细胞。可见激活的淋巴细胞贴近神经元，周围组织疏松、水肿。髓鞘呈松散的层状结构，有脱失及融合，明暗相间消失。轴索内线粒体肿胀，微管结构模糊不清，或细胞器完全消失。神经元细胞质内结构松散，内质网扩张脱颗粒，神经元变性。同一髓鞘的内板层松解和轴突髓鞘分离。

　　磁共振成像扫描发现动物模型的病灶多分布于脑室周围，病灶大小不一，边缘稍模糊，散在长椭圆性长T1长T2异常信号影，可有明显占位效应。这与人类MS(mass spectroscope)的影像学改变有相似之处，说明了该模型的可靠性。