流式细胞仪 中国实验动物信息网 2020-08-14 881

　　调试和校准

　　流式细胞仪在使用前，甚至在使用过程中都要精心进行调试，以保证工作的可靠性和*佳性。调试的项目主要是激光强度、液流速度和测量区的光路等。

　　(1) 激光强度调节：除调整反射镜的角度以调整到所需波长的激光出光外，还要结合显示屏上的光谱曲线使激光的强度输出为*大。

　　(2) 液流速度调节：可通过操作台数字显示监督，调节 气体压力大小以获得稳定的液流速度。

　　(3) 测量区光路调节：这是调试工作的关键。需要保证在测量区的液流、激光束、90散射测量光电系统垂直正交，而且交点较小。一般可在用标准荧光微球等校准中完成。

　　流式细胞术中所测得的量是相对值，因此需要在使用前或使用中对系统进行校准或标定，这样才能通过相对测量获得绝对的意义。因而FCM中的校准具有双重功能：仪器的准直调整和定量标度。标准样品应该稳定，有形成份形状应是大小比较一致球形，样品分散性能良好，且经济、容易获得。常用标准荧光微球作为非生物学标准样品，鸡血红细胞做为生物学标准样品。

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　　微球用树脂材料制作，或标有荧光素，或不标记荧光素。所用的鸡血红细胞标准样品制作过程昭下：取3.8%枸橼酸或肝素抗凝的鸡血(抗凝剂：鸡血=1：4)，经PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛与清洗后的鸡红细胞混合，室温下振荡醛化24h，*后经PBS再清洗，贮4℃冰箱中备用。需要指出的是因为未经荧光染色，所测光信号为鸡血红蛋白的自发荧光。

　　1.4.2 仪器的操作和使用

　　(1) 打开电源，对系统进行预热；

　　(2) 打开气体阈，调节 压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统；

　　(3) 在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；

　　(4) 利用校准标准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上，0和90散射的荧光强度*强，并要求变异系数为*小；

　　(5) 选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品;同时选择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程；

　　(6) 样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统；

　　(7) 因为实验数据已存入计算机硬盘(有的机器还备有光盘系统，存贮量更大)，因此可关闭气体、测量装置，而单独使用计算机进行数据处理；

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　　(8) 将所需结果打印出来。

　　1.4.3 操作和使用中的注意事项

　　(1) 光电倍增管要求稳定的工作条件，暴露的较强的光线下以后，需要较长时间的“暗适应”以消除或降低部分暗电流本底才能工作；另外还要注意磁屏蔽；

　　(2) 光源不得在短时间内(一般要1h左右)关上又打开;使用光源必须预热并注意冷却系统工作是否正常；

　　(3) 液流系统必需随时保持液流畅通，避免气泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要经过过滤、消毒；注意根据测量对象的变换选用合适的滤片系统、放大器的类型等；

　　(4) 特别强度每次测量都需要对照组