动物造模,CRISPR/Cas9技术 中国实验动物信息网 2023-04-18 1235

　　目的    利用 CRISPR/ Cas9 基因编辑技术高效构建 Bpi 基因敲除的小鼠模型,并继续繁殖、鉴定及建稳定遗传的 Bpi 基因敲除小鼠品系。

　　方法    针对 C57BL/ 6 小鼠 Bpi 基因的第 2~3 外显子两端设计敲除靶点,筛选高活性 gRNA(guide RNA)靶点,体外转录得到 sgRNA(small guide RNA)并与 Cas9 mRNA 一起显微注射到 C57BL/ 6 小 鼠的受精卵内,经胚胎移植至代孕母鼠体内,获得 F0 代小鼠后,通过基因型鉴定和 DNA 测序获得基因突变的阳性子代鼠。

　　结果    筛选到高活性 gRNA 靶点并成功获得体外转录产物 sgRNA;与 Cas9 mRNA 一起通过显微注射的方式获得了 64 枚状态良好的受精卵并成功移植到 2 只代孕母鼠体内;获得了 22 只 F0 代小鼠,经 PCR 鉴定和 DNA 测序后 选择一只单链缺失 708 bp 碱基的阳性小鼠进行扩繁,并在 F1、F2 代检测到该突变,且 F2 代成功繁育出纯合子小鼠。

　　结论    成功构建 Bpi 基因敲除小鼠模型,为进一步研究 Bpi 基因及其表达产物的生物学功能奠定了基础。