动物实验,H5N1病毒 中国实验动物信息网 2020-08-12 845

　　1.雪貂血清学筛选  雪貂在感染前进行流感的血清学筛选，至少目的流感病毒血清学检测结果为阴性的动物方可入组。

　　2.材料与方法

　　(1)实验用病毒：为SPF鸡胚传代所收获的尿囊液。测定病毒液TCID50为10的8次方/ml。

　　(2)动物及感染方法：4～10月龄雪貂，体重500～1000g，感染前进行血清抗体检测，检查H5N1病毒抗体及当即流行的流感的抗体为阴性的雪貂为合格，可入选实验。雪貂经鼻腔接种100TCID50(500μl体积)。所有动物实验均在ABSL-3实验室中进行。感染的第5天安乐处死雪貂取材。

　　(3)临床观察：雪貂实验前皮下植入芯片，每天通过芯片读取体温一次，每天称量体重一次，观察有无咳嗽、流涕、呕吐、腹泻、气促、呼吸困难、明显食欲缺乏等临床表现，详细记录备案。

　　(4)病毒分离：在病毒接种1d后，每天收鼻甲骨活检物标本，放入1ml DMEM培养液中备用。标本接种MDCK细胞，吸附1小时，进行病毒分离。感染后第5天感染雪貂安乐处死，尸检时取肺、气管、肝、脾、脑、肠、心和肾组织，研磨处理后，接种MDCK细胞。每天观察细胞病变，持续观察3d，用火鸡红细胞测定HA确认。HA方法具体为：将接种标本的MDCK细胞上清液取出50μl，加入等体积火鸡红细胞，室温反应30min，出现凝集反应，结果为阳性。

　　(5)H5N1病毒RNA的检测：在H5N1病毒接种动物1d后，每天收集鼻甲骨活检物，在ABSL-3实验室内提取病毒RNA，操作步骤：将100μl鼻甲骨活检物标本移入裂解液(Qiagen)中，放入buffer RLT(已加入1％巯基乙醇)350μl，4℃13000rpm离心3min，将上清转移至新1.5ml微量离心管中，提取鼻甲骨活检物样品病毒核酸。将RNA逆转成cDNA，通过荧光定量PCR仪直接测定病毒载量。

　　(6)H5N1病毒抗体检测：动物在处死后采血分离血清，－80℃下保存备用。血清H5N1病毒性抗体检测(H1方法)具体操作步骤为：每孔加入1：10～1：1280稀释的待检血清，加入8HA的病毒，室温孵育30min。此后检测凝集结果，血清凝集的效价为该血清可中和的抗体的效价。

　　(7)病理学研究：大体观察，处死动物后，详细观察肺、心、脾、肾、肝、脑、肠以及淋巴结等组织的形态变化；病理切片制备，取处死动物的肺等组织，10％甲醛固定，石蜡包埋，常规病理组织切片处理后，HE或免疫组织化学染色后，镜检观察。

　　3.雪貂感染H5N1模型指标和结果  雪貂在实验前1周测正常体温和体重，确定正常值，雪貂在H5N1病毒接种的第2天时体温升高，体温升高0.5～2℃，体温升高持续3d左右，临床有死亡现象。雪貂感染后出现流涕，打喷嚏，有呼吸困难，摄食减少，精神萎靡，活动度下降，对外界刺激无反应等临床表现。病毒感染雪貂后第1天到第5天，用RT-PCR方法可从鼻甲骨活检物中检测到病毒载量。从雪貂的鼻甲骨标本、肺组织标本中，经MD- CK细胞培养，接种细胞产生典型细胞病变(CPE)，提示病毒感染了雪貂并有病毒的复制和排毒，鼻甲骨标本分离阳性的高峰期在2～6d。可在脑、心、肝、脾、肠、肾、淋巴结组织中分离到活病毒，此结果证明H5N1病毒可以在呼吸道以外的组织器官中复制、繁殖。用HA方法可证实MDCK细胞有H5N1抗原存在。在H5N1病毒接种前和接种后第5天安乐时，经静脉采血1ml分离血清，检测血清中H5N1病毒特异性抗体。感染雪貂在5天安乐死时，均为阴性。解剖大体观察可发现肺组织表面局部有轻度实变现象，镜检可见肺泡腔内的明显炎性渗出物，伴有淋巴细胞、吞噬细胞浸润。肺间隔广泛增宽伴大量单核细胞为主的炎细胞浸润，肺泡受压变形变小，并有局限性肺泡间隔增宽后相互融合，部分区域有大片状肺泡间隔增宽后相互融合。肺泡间隔内有淋巴细胞、浆细胞、吞噬细胞，病变范围广泛，呈中重度间质性肺炎，见图8-3。