动物造模,DOCA盐性高血压动物模型 中国实验动物信息网 2021-04-06 2054

　　一、DOCA盐性高血压概述

　　人类高血压按其发生机制分为原发性高血压和继发性高血压两大类。在继发性高血压中，原发性醛固酮增多症占有重要的地位。原发性醛固酮增多症(primary aldosteronism，简称原醛症)是由于肾上腺皮质发生病变(多数为腺瘤，少数为增生)，分泌过多的醛固酮，导致水钠潴留，血容量增多、肾素-血管紧张素系统受抑制，出现以高血压、低血钾、肌无力和夜尿增多为主要临床表现的一组临床综合征，属于不依赖肾素-血管紧张素的盐皮质激素增多症。DOCA盐性高血压是一种去氧皮质酮醋酸盐导致高血压，此种高血压的动物模型是膳食营养素的实验研究的基础。并与人类高血压中的原发性醛固酮增多症相似，而采用醛固酮拮抗剂能治疗DHR(去氧皮质酮醋酸盐导致的高血压大鼠)的疾病。此种动物模型可以用于研究人类的醛固酮增多症性疾病。

　　二、DOCA盐性高血压血压升高机制

　　DOCA盐性高血压的发病机制与RAS无关，因为DHR的肾素水平低下，AT1受体拮抗剂不降低其血压。引起DHR的因素有：

　　(一)盐的作用  盐是形成DHR一个很重要的因素，单用DOCA血压不升高，加盐后首先出现细胞外液和血液容量增加，肾功能和结构改变，肾小动脉硬化，肾和心脏及动脉壁肥厚，然后才出现血压明显升高。

　　(二)DOCA的作用  由于在模型制作过程中使用了大剂量的DOCA(醛固酮的前体)，它与醛固酮有相似的生理作用，能够引起潴钠、排钾、细胞外液扩张，血容量增多，血管壁内及血循环钠离子浓度增加，血管对去甲肾上腺素的反应加强等原因引起高血压。由于体液容量扩张而反馈性抑制循环肾素一血管紧张素系统，导致血浆肾素活性低下。因此，是一一种低。肾素性高血压模型。

　　(三)血管加压素(AVP)的作用  CNS在DHR发病机制中起了重要作用，钠潴留影响血管功能，DHR在血压未明显升高以前，即对外源性NE，E和AngⅡ的升压反应增加。大鼠在给予DOCA的同时，脑室内慢性输注NaCl溶液可引起血压升高，DHR血浆中的加压素增加几倍，恶性高血压尤为明显。加压素抗血清或注射能阻断加压素升压作用的加压素类似物可降低DHR的血压。有一种大鼠(Brattboro大鼠)给DOCA-盐后血压不上升，当注射加压素后血压稳定上升。说明加压素在DHR的发生过程中起了重要的作用，但也有人持不同看法，加压素所起作用有待于进一步研究。

　　三、去氧皮质酮醋酸盐导致的高血压大鼠(deoxycorticosterone acetate-salt induced hypertensive rats, DHR)的动物模型建立

　　此模型是一种继发性高血压模型，严格地按照饮食控制的条件制作去氧皮质酮醋酸盐

　　导致的高血压的动物模型。制备此种高血压的动物模型是膳食营养素的实验研究的基础。并与人类高血压中的原发性醛固酮增多症相似，醛固酮拮抗剂能防止DHR的形成。

　　(一)SelyeDHR模型的建立  早在1943年，Selye报道Addison患者饮用过量氯化钠后出现血压升高，以后他给幼年大鼠皮下注射人工合成的去氧皮质酮醋酸盐(DOCA)，并饮用1％盐水，即能引起大鼠血压明显升高。此后为了形成DOCA盐性高血压大鼠(DHR)，常采用以下方法：4～6周龄大鼠，雌雄均可，在乙醚或氯胺酮(ketamine)麻醉下，切除一侧肾脏，颈背部皮下埋藏含DOCA的胶丸，DOCA的剂量为100mg/kg。手术后给大鼠饮1％ NaCl溶液。4～6周后即能形成稳定的高血压，SBP一般在180mmHg以上，尚可发展成恶性高血压。单给DOCA只能引起暂时的细胞外液增加和血压升高，4周后血压恢复到正常水平，只有合并应用DOCA和高盐才能引起血压稳定上升，切除一侧肾脏后血压升高更明显。

　　1．制备方法  去氧皮质酮醋酸盐导致的高血压大鼠(deoxycorticosterone acetate-salt induced hypertensive rats, DHR)模型制作有两种方法。

　　长期以来，人们一直采用Selye1943年创立的皮下注射法形成DOCA-salt高血压大鼠模型，这是一种经典的造模方法。其制作方法如下：

　　(1)取SD大鼠雄雌均可，重量为150-～200g。

　　(2)用乙醚或3％戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉后固定，剪去腹部手术视野的毛，用0.05％氯己定酒精消毒皮肤。于剑突下1.5cm处，沿腹正中线切开皮肤及肌层，右手食指伸入腹腔摸着左侧肾脏，左手指从腹部外侧配合将肾脏轻轻挤出，用浸有生理盐水的棉花包住，然后用左手食指与拇指将其固定。右手用无钩直头眼科镊小心分离肾蒂部筋膜，沿深静脉下方分离肾动脉，在近主动脉端结扎肾动脉。依此方法再结扎深静脉及输尿管，然后用手术刀切除左侧肾脏及肾上腺(左侧肾上腺用小刀在包膜上切一小口，用弯头无钩眼科镊轻压肾上腺，将髓质及大部分皮质剔除)。*后缝合腹部肌肉与皮肤切口，碘酒消毒。

　　(3)术后的大鼠皮下注射1万～2万U青霉素钠盐(5×10000UPG/d)。

　　(4)术后喂1％盐水，皮下注射DOCA油剂10mg/W，共四周，注射时需严格消毒且要经常更换注射部位，以防感染和确保DOCA有效吸收。

　　(5)术后2周大鼠血压和血浆去氧皮质酮含量明显升高，术后7～14周血浆去氧皮质酮下降至正常，但血压仍维持在高水平。

　　2．DOCA油剂用法和用量的问题

　　(1)每周一次法：每周一次，每次DOCA 50mg/kg。

　　(2)每周两次法：每周二次，5mg/只。至于青霉素钠盐(5×10000UPG/d)治疗时间，有人建议抗感染1周。

　　(3)手术法：采用背部切口，其方法是：用乙醚或3％戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉后，大鼠呈俯卧位固定，腹部下方垫一高约2～3cm的砂袋，剪去手术视野的毛，用0.05％氯己定酒精消毒皮肤，从第10胸椎到第3腰椎处沿脊椎中线切开皮肤，在左侧季肋下1.5～2cm和距脊椎1cm处用小血管钳分开肌肉，用两指从腹下部将肾脏自创口中挤出，小心地将肾脏与周围组织剥离，分离后切除该肾脏，然后分别缝合肌肉和皮肤创口。

　　手术所用器械无需高压消毒，只要在75％酒精中浸泡30分钟，临用时用煮沸过的生理盐水冲洗一下，用毕后仍浸入酒精中。

　　由于该法需反复多次给大鼠皮下注射DOCA油剂或悬液，高血压形成时间也较长，从而增加了大鼠的感染机会和试验人员的劳动强度。

　　(4)硅胶渗入法：1973年HS Ormsbee和CF Ryan首先用渗入DOCA的硅胶管(长50mm，直径约6mm)埋入大鼠皮下形成DOCA-salt高血压，克服了皮下注射法的缺点。近年来，国外一些研究人员开始采用这种新方法，由于DOCA硅胶索的制作工艺复杂，使该法的普及推广有一定困难。

　　(二)改良DHR模型的建立  1993年国内学者王青等在国内率先使用并改进该技术。其详细制备方法如下：

　　1．DOCA硅胶管的制作方法  用外径4mm、内径2.5mm的人体硅胶管，取长25mm，管壁钻10～14μm的微孔，管内填入100mgDOCA药粉，再用长1.5mm、直径2.5mm的细硅胶管封堵住管的两端开口。用前，将DOCA硅胶管在青霉素生理盐水溶液(1×100000UPG/ml)中浸泡30分钟。

　　2．DOCA-salt高血压大鼠模型的制备方法  体重(140±9)g雄性SD大鼠(*军医大学实验动物中心提供)用3％戊巴比妥钠30mg/kg腹腔麻醉。麻醉后固定，去腹部毛，消毒。

　　3．摘除左肾及肾上腺(方法同前)。

　　4．DOCA皮下埋管  于大鼠右下腹皮下置入DOCA硅胶管，*后缝合腹部肌肉与皮肤切口，碘酒消毒。

　　5．术后喂1％盐水，所有大鼠连续3天肌肉注射青霉素钠盐(5×10000UPG/d)。

　　王青等认为，DOCA皮下埋管与皮下注射法相比，手术后前8周的血压呈直线性上升，但前者升压速率明显快于后者，增加DOCA硅胶管上的孔数并不能进一步增加升压速率(10孔数即可)。总之，与DOCA皮下注射法相比，DOCA皮下埋管法具有如下优点：①高血压的形成时间较短且形成率高(88％)，升压速率较快(3周)，升压幅度较大：②方法简便可靠，重复性好，易于普及推广；③减少了动物的感染机会和减轻了实验人员的劳动强度。

　　四、应用价值

　　该模型是一种继发性高血压模型，与人类高血压中的原发性醛固酮增多症相似。故可以用于原发性醛固酮增多所致高血压的研究。另外，文献中有用DOCA盐诱导的高血压大鼠进行肾脏的研究，如波生坦对高血压大鼠肾脏的保护作用；或者利用该模型观察降压药物对血管功能的保护作用，如依那普利不对DOCA-盐诱导的高血压大鼠发生影响，以及西拉普利可以刺激一氧化氮合酶的表达从而改善去氧皮质酮醋酸盐导致的高血压大鼠的心肌重构。同时在中医、中药的研究中也广泛应用，如基质金属蛋白酶-2在DHR心脏中的表达及麝香保心丸的影响。

　　鼠(MHS, 米兰)、里昂高血压大鼠(LH, 里昂)等。其中SHR是*广泛应用的模型动物之一。

　　SHR是1963年东京Okamoto用Wistar大鼠培育而成的，其被毛呈白色。此鼠高血压发生率高，在16周龄时高血压已形成，收缩压>160mmHg，无明显原发性肾脏或肾上腺损伤，心血管疾病发生率高。该品系血压高且可稳定遗传，血压增高均在自然条件下发生，能形成典型的高血压并发症。SHR高血压形成的病因是多因素的，与人类原发性高血压形成机制有相似之处，血压的升高均与外周血管阻力的增加有关，且对抗高血压药物有反应，因此，它是人类原发性高血压的机制研究及高血压药物筛选的较为理想的动物模型。

　　(一)遗传背景

　　1．起源  源于东京远交系Wistar大鼠，用群体动物中患有自发性高血压的一只雄鼠(血压值为145～175mmHg)与一只血压升高的雌鼠(血压值为130～140mmHg)交配繁殖，之后进行兄妹连续交配，以获得自发性高血压动物模型。SHR是突变系动物，通过遗传定向培育而成。

　　2．SHR  自发性高血压大鼠各国已培育出不同的品系，如日本冈本(Okamoto)教授培育的SHR；Smirk等培育的新西兰种GHR；Bianchi等培育成功的米兰种大鼠MHS；由Dahl等培育成功的Brookhaven种高血压敏感大鼠HSR等品系。

　　3．毛色  白化。

　　(二)品系特征及用途  该品系中的动物有发生脑血管损伤和中风的趋势，10周龄以后动脉收缩压雄鼠为：200～350mmHg，雌鼠为180～200mmHg。心血管疾病发病率高，但是肾和肾上腺未见器官损伤，基因分析表明这一情况受3～4个基因控制，其中一个可能是主要的。雄性SHR大鼠的发病率高达70％～80％，*高血压可达230mmHg；雌性SHR大鼠发病率较低，*高血压也只有170mmHg，这样，相对而言，雄性SHR大鼠的发病率高而且稳定。SHR大鼠发病时主要表现为易受惊吓、站立不稳，惊吓时异常烦躁等症状，SHR雄性大鼠大约在7周龄时平均血压达到135mmHg，并随年龄的增长血压值也平缓升高，4月龄以后血压值可达到或高于200mmHg。

　　(三)SHR的饲养与管理  SHR对环境和营养的要求较高。

　　1．环境控制  采用SPF屏障环境饲养，自由摄食60Co辐照灭菌颗粒饲料，饲养间温度为(22±3.5)℃，相对湿度45％～55％，人工控制光照(昼12小时、夜12小时)，氨浓度小于20ppm，饲料、垫料经高压灭菌，饮水为冷开水，夏季每天更换垫料，冬季每周换窝三次，地面、笼架每天用消毒液擦干净。

　　2．饲喂  为满足种鼠和乳鼠的营养需要，种鼠交配前一周起至乳鼠断奶，种鼠和乳鼠除饲喂全价颗粒饲料外，还需饲喂用奶粉、鸡蛋做成的蛋糕。

　　(四)SHR的生长与发育

　　1．乳鼠初期发育  出生乳鼠全身裸露无毛，仅口周有些细须；4日龄乳鼠在光线下可见其头、背、四肢等部位长出稀疏的细毛，6日龄乳鼠能开始爬行；9日龄乳鼠被毛变粗变密；10日龄，下切齿齿冠突破龈膜开始露出；11日龄，上齿开始露出；15日龄，乳鼠腹部长毛，全身被毛开始长满：17～18日龄，乳鼠睁眼；30日龄左右可离乳。

　　2．体重增长  仔鼠出生后，每过一周称体重，各时期体重情况，第4周至第12周是其体重迅速增长的重要时期，这段时期应提供充足的营养，在整个生长发育过程，SHR的生长发育速度都比封闭群的Wistar和SD大鼠慢，体现出近交突变系与封闭群在生长发育方面的差异。

　　3．繁殖  采用近交系的全同胞兄妹法进行配种繁殖，一般SHR的*胎、第二胎产仔数较多，平均可达9只，第3胎开始下降，平均为7只，第4胎平均为5只，第4胎以后，种鼠一般失去生育能力，应及时淘汰。配种时值得注意的是，将雄鼠置于雌鼠笼中～周，然后将雄鼠分开，雌鼠怀孕率可达100％，反之雌雄种鼠不及时分开，乳鼠可能被踩死，使离乳率降低。