疾病动物模型,Duox2基因突变 中国实验动物信息网 2021-03-11 508

　　【造模机制】在甲状腺素合成中，甲状腺球蛋白的碘化反应需要过氧化氢和甲状腺过氧化物酶的催化，双氧化酶(dual oxidases,DUOX)在此过程中提供过氧化氢。DUOX2基因突变可引起甲减症。

　　在B6.129-Tnfrsfla tmlMak/J小鼠同类系中发现自发性突变。基因分析发现第2对染色体的Duox2基因第16外显子突变。

　　【造模方法】Tnfrsfla tmlMak突变小鼠发现后，将thyd突变基因导入到C57BL/6J背景中，命名为 B6(129)-Duox2thyd/J。纯合子突变小鼠本身不能繁育，需通过卵巢移植并与雄性C57BL/6J交配，将突变基因导入C57BL/6J小鼠中，以杂合子形式保种。杂合子互相交配，产生纯合子突变小鼠用于实验。

　　【模型特点】纯合子thyd突变小鼠体形较同窝其他小鼠小，成年8周龄突变小鼠长骨短、骨密度低，骨化不全，皮下脂肪少，血清中IGF-1低。

　　突变小鼠垂体和甲状腺异常。甲状腺肿大，仅有少量正常滤泡；神经垂体和中叶正常，但前叶发育不良，含有大量的异常细胞。血清T4低于正常对照10倍。TSH高于正常对照100～1000倍。

　　突变小鼠听力受损，听力刺激反应比正常对照高50～60dB，耳蜗发育迟缓。

　　【模型评估和应用】自发性甲减症小鼠模型由于Duox2基因突变导致甲状腺素生物合成受到影响，引起甲减症，因此主要用于遗传性先天性甲减症研究。

　　此模型可应用于甲状腺素的生物合成、甲减症的发病机制等研究。由于DUOX2基因突变不仅影响甲状腺素的合成，也影响其他器官的发育，如垂体发育、长骨骨化等，并不完全符合甲减症的临床表现，用此模型在分析实验结果时应加以注意。  三、基因修饰甲减症小鼠模型

　　1．TTF-1基因敲除甲减症小鼠模型

　　【造模机制】甲状腺特异性转录因子1(thyroid-specific transcription factor 1,TTF-1)又称甲状腺特异性增强子结合蛋白(thyroid-specific enhancer-binding protein)，是转录因子家族的一个成员，含有同源框域。TTF-1在胚胎器官形成中极其重要， TTF-1基因敲除将导致死胎，缺乏甲状腺和垂体腺，肺和前脑腹侧、基部缺陷，以及苍白球结构发育不全。

　　TTF-1基因表达甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白和促甲状腺激素受体3种蛋白。这三种蛋白对甲状腺素的生物合成至关重要。，TTF-1基因敲除导致先天性甲减症。

　　【造模方法】含有TTF-1基因的整个编码区和3'端非编码区序列共5.9kb用来构建打靶载体，正筛选neor基因插入到TTF-1基因的第2外显子中间，导致同源域序列的第1个螺旋破坏；tk表达盒用于非同源重组的负筛选。筛选出的定点整合 ES细胞克隆显微注射到C57BL/6小鼠囊胚内，产生玖合体小鼠。5/9的雄性嵌合体小鼠将ES细胞基因组传给了后代。

　　【模型特点】杂合子小鼠发育正常。纯合子小鼠出生时即死亡，无甲状腺，但有正常的甲状旁腺，缺乏肺实质，但具有基本的支气管树，胸膜腔上皮异常，纯合子小鼠脑内广泛缺陷，特别是前脑的腹部。整个垂体(包括前叶、中叶和后叶)缺乏。原位杂交显示TTF-1基因在胚胎发生早期在正常甲状腺、肺支气管上皮和前脑的特异性区域表达。

　　【模型评估和应用】此模型可用于先天性甲减症胎仔发育的研究。由于TTF-1在胚胎多种器官形成中起作用，TTF-1基因敲除不仅影响甲状腺素的合成，也影响其他器官(如脑、垂体、肺脏等)的形成，并不完全符合先天性甲减症的临床表现，用此模型在分析实验结果时应加以注意。

　　2．Pax8基因敲除甲减症小鼠模型

　　【造模机制】一些小鼠基因含有与果蝇成对盒同源的高度保守DNA序列，称之为“Pax基因”，Pax8基因在器官形成过程中起重要作用。从妊娠10.5天起，Pax8基因在甲状腺开始表达，Pax8基因敲除影响甲状腺的形成。

　　【造模方法】Pax8基因的第2外显子用 pGKNeopA取代，在打靶载体的3'端插入tk基因。    【模型特点】杂合子Pax8基因敲除小鼠健康可生育。杂合子互交产生纯合子。纯合子生后1周就表现明显的发育迟缓，断乳后死亡。胎仔的组织学分析甲状腺缺陷。纯合子Pax8基因敲除小鼠在胎仔15.5～18.5天时未能检出甲状腺滤泡细胞编码的甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶的后期基因表达。其他表达Pax8的器官，如脊髓、中脑/后脑边缘或肾脏正常。

　　纯合子Pax8基因敲除小鼠甲状腺较小。无滤泡。免疫组织化学显示新生鼠的甲状腺完全由甲状腺C细胞组成。2周龄时血清甲状腺素水平明显下降，补充外源性甲状腺素可延长生存至6月龄。

　　【模型评估和应用】此模型可用于先天性甲减症胎仔发育的研究。

　　3．DHTP/B6双基因敲除甲减症小鼠模型

　　【造模机制】TTF-1和Pax8是器官发生的重要转录因子，在甲状腺分化时起着重要的作用。当这两种转录因子同时缺陷时，可产生甲减症。

　　【造模方法】杂合子TTF1基因敲除小鼠和杂合子Pax8基因敲除小鼠交配产生，TTF1和 Pax8双杂合子DHTP突变小鼠。DHTP小鼠再在 C57BL/6J背景下回交10代，99％以上遗传背景来自C57BL/6J，得到杂合子TTF1、杂合子Pax8和双杂合子DHTP突变小鼠。双杂合子DHTP突变小鼠用做模型。

　　【模型特点】3月龄DHTP/B6小鼠与单基因敲除杂合子或野生型比较，体重和T4水平明显降低。组织学检查甲状腺不规则、弥漫性增生，滤泡内皮呈长柱状细胞；免疫化学显示滤泡细胞的钠碘转运体表达增加。尽管血清TSH浓度上升，但甲状腺不肿大，比正常对照组略小。约30％的小鼠甲状腺单侧缺如，呈单叶状，略肿大，位置正常但仅在一侧气管旁。

　　妊娠第15～16天，DHTP/B6小鼠胎仔的甲状腺小于野生型对照，并持续到妊娠结束。约30％的胎仔甲状腺是单叶的，与成年DHTP/B6小鼠观察到的是一致的。因此，甲状腺发育不全及在成年 DHTP/B6小鼠观察到的单侧缺如是先天性的。妊娠第18天，DHTP/B6小鼠胎仔的甲状腺球蛋白和碘甲腺原氨酸脱碘酶Ⅰ型mRNA显著下降。

　　【模型评估和应用】此模型可用于原发性遗传性先天性甲减症的研究，并可用甲状腺素替代疗法。由于DHTP/B6小鼠是双杂合子突变小鼠，因此每次实验需要杂合子TTF1、杂合子Pax8和野生型作为对照。

　　TTF-1基因敲除小鼠和Pax8基因敲除小鼠的杂合子表现正常，纯合子均在出生时或断乳时死亡，主要用于先天性甲减症对胎仔影响的研究。

　　TTF-1和Pax8双基因敲除双杂合子小鼠(DHTP/B6)是一个很好的遗传性先天性甲减症模型，它显示了人遗传性先天性甲减症的很多临床表现，并可用甲状腺素进行早期替代治疗。