SARS-CoV-2,心肌细胞 中国实验动物信息网 2020-12-18 521

　　COVID-19是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的大流行。COVID-19由呼吸道症状定义，但病毒性心肌炎在内的心脏并发症也很普遍。虽然COVID-19引起的缺血和炎症反应会损害心脏功能，但SARS-CoV-2感染对人心肌细胞的直接影响还不清楚。我们利用人类诱导的多能干细胞衍生的心肌细胞（hiPSC-CMs）作为模型来检查SARS-CoV-2引起的心肌细胞特异性感染的机制。显微镜和RNA测序表明SARS-CoV-2可以通过ACE2进入hiPSC-CMs。SARS-CoV-2病毒复制和细胞病变效应可导致hiPSC-CM凋亡并在感染 72小时后停止跳动。SARS-CoV-2感染可激活先天性免疫应答和抗病毒清除基因途径，同时抑制代谢途径并抑制ACE2表达。这些研究表明，SARS-CoV-2可以在体外感染hiPSC-CM，从而建立了阐明感染机制的模型和潜在的心脏特异性抗病毒药物筛选平台。

　　简介：已知SARS-CoV-2是一种单链包膜RNA病毒，它使用ACE2受体进入宿主肺组织，然后迅速进行病毒复制。临床症状主要是肺部症状，包括咳嗽，呼吸急促，肺炎和急性呼吸窘迫综合征。然而，越来越多的证据表明，SARS-CoV-2感染可能导致心脏并发症，包括心脏应激生物标志物升高、心律失常和心力衰竭。*近的一项研究显示，一些COVID-19患者的肌钙蛋白水平显著升高，这表明心脏损伤，尤其是心脏损伤与死亡风险增加相关。然而，COVID-19心肌损伤的病因尚不清楚。心脏损伤可能是缺血介导的，炎症和血流动力学影响被认为是导致动脉粥样硬化斑块破裂或氧供需失调导致缺血的原因。另外，心肌组织表达ACE2受体，这进一步表明SARS-CoV-2在心肌细胞内直接内化的可行性。在扩张型和肥厚型心肌病中ACE2在心肌细胞中也表达上调。重要的是，已经注意到相关的SARS-CoV病毒位于心肌内，并且*近的研究表明SARS-CoV和SARS-CoV-2的病毒基因组中有79％的序列保守性。从结构上讲，两种病毒都使用ACE2受体进入细胞并以与ACE2相似的亲和力结合。鉴于这些与SARS-CoV的相似之处，SARS-CoV-2也可以使用ACE2进入成年心肌细胞似乎是合理的。初步的COVID-19临床病例报告增加了人们对直接心肌SARS-CoV-2感染和暴发性心肌炎介导的心脏损伤的怀疑。*近对COVID-19患者进行的多器官尸检研究通过PCR在心脏中检测到SARS-CoV-2病毒RNA。但是，用于确认SARS-CoV-2在心肌细胞中定位的金标准是心内膜活检（EMB），这是一种侵入性手术，在COVID-19的情况下进行EMB也必须采取额外的安全预防措施。因此，目前仅有有限的临床数据证明了SARS-CoV-2定位于成年人类心肌细胞。为了进一步了解COVID-19的心脏病理生理，确定SARS-CoV-2是否可以直接感染分离的人心肌细胞至关重要。阐明COVID-19体外心脏损伤的致病机制*终可以指导治疗策略。 如果心脏损伤的潜在机制是直接心肌病毒感染，则抗病毒药可能会减轻心脏并发症。

　　很难获得和维持原代人心肌细胞以用于研究。将人类诱导的多能干细胞（hiPSC）转换为多种体细胞系的改良方法，使得能够在体外大量生产患者特异性细胞，包括hiPSC衍生的心肌细胞（hiPSC-CM）。hiPSC-CMs表达在成人CMs中发现的相关蛋白质，可以自发收缩，可以使用定义的分化方案在数周内制成，并且可以使用基因组编辑进行遗传定制。HiPSC CMs表达ACE2，其在分化90天后表达增加。hiPSC-CM还对药物（如去甲肾上腺素）有反应，可以通过电刺激控制搏动率。由于hiPSC-CMs可以被纯化和移植用于下游应用，学术界和工业界的研究小组现在利用这些细胞进行心血管疾病建模和高通量药物筛选分析。HiPSC-CMs可以重现心血管疾病的细胞表型，包括各种形式的心肌病和药物引起的心脏毒性。值得注意的是，hiPSC-CMs也显示出有望成为研究病毒性心肌炎直接感染心肌细胞机制的体外模型。

　　先前的研究表明，CVB3是病毒性心肌炎的主要病原体之一，可以在hiPSC-CMs中快速感染并增殖。与SARS-CoV-2一样，CVB3是一种正义单链RNA病毒，尽管与SARS-CoV-2不同，它没有病毒包膜。hiPSC-CMs产生coxsackie 和腺病毒受体蛋白，这是CVB3感染所必需的。在感染CVB3后的数小时内，在hiPSC CMs中观察到有害病毒诱导的细胞病变，表现为细胞死亡和收缩不规则。重要的是，该研究还建立了hiPSC-CMs作为心脏特异性抗病毒药物筛选平台，并证明了干扰素β和利巴韦林等药物可在体外阻碍CVB3增殖。

　　前述基础病毒性心肌炎研究已扩展至评估SARS-CoV-2对hiPSC-CM的作用。显示SARSCoV-2易感染hiPSC-CMs，导致功能改变，转录变化和细胞病变效应。这些细胞表型发生在没有全身炎症和血流动力学影响的情况下，建立了一个研究SARS-CoV-2感染的体外心脏平台。

　　结果： 人诱导的多能干细胞可分化为心肌细胞：

　　Cedars-Sinai医疗中心iPSC Core从外周血单核细胞中产生了一个hiPSC对照系，显示其具有全能性。利用Wnt信号的小分子调节剂，利用已建立的单层分化方案将hiPSC分化为hiPSC-CMs。如前所述，分化的hiPSC-CMs通过去除细胞内的葡萄糖进行代谢纯化。纯化的hiPSC-CMs表达标准的心脏肌节标记物心肌肌钙蛋白T（cTnT）和α-肌动蛋白。

　　SARS-CoV-2可以直接感染纯化的hiPSC-CM：

　　将纯化的hiPSC-CM重新接种到96孔板中，每孔100,000个细胞，并在SARS-CoV-2感染前恢复收缩力。SARS-CoV-2从美国过敏和传染病研究所（NIAID）的生物防御和新兴感染（BEI）资源中获得，并在Vero-E6细胞上滴定。除非另有说明，否则在hiPSC-CM上进行剂量反应和时间进程，并且所有实验的感染复数（MOI）选择为0.1。在所有实验中，SARS-CoV-2感染hiPSC-CMs长达72小时，除非另有说明，以无病毒的模拟治疗作为对照条件。对hiPSC-CM感染后采集的上清液进行菌斑形成分析，证实SARS-CoV-2感染活跃。被感染的hiPSC-CM的棘突蛋白染色呈阳性，这表明SARS-CoV-2可以在hiPSC-CM中建立主动感染。如前所述，用ACE2抗体对感染的hiPSC-CMs进行预处理可显著降低病毒蛋白的表达和斑块形成，表明ACE2对SARS-CoV-2内在化至关重要。

　　SARS-CoV-2感染hiPSC-CMs可引起细胞凋亡和搏动停止：

　　为了确定SARS-CoV-2是否对hiPSC-CMs产生细胞病变效应，对模拟的和感染的hiPSC-CMs的凋亡标记物切割caspase-3以及正义RNA病毒感染所特有的双链RNA（dsRNA）中间产物进行染色。dsRNA和棘突蛋白染色是两种独立的检测方法，用于显示hiPSC-CMs中SARSCoV-2病毒的摄取和基因组复制。一定比例的被感染细胞对dsRNA呈阳性，对caspase-3裂解也呈阳性，表明hiPSC-CM正在经历病毒诱导的凋亡。用ACE2抗体预处理感染的hiPSC-CMs可显著降低caspase-3的表达，并抑制细胞凋亡。值得注意的是，SARS-CoV-2棘突蛋白位于hiPSC-CMs的核周区域，与先前在非心肌细胞中冠状病毒感染和在hiPSC-CMs上感染coxsackie病毒的结果一致。dsRNA中间产物表现为细胞质定位。染色细胞的定量表明，dsRNA和刺突蛋白以及裂解的caspase-3阳性的总细胞百分比。dsRNA中间产物表现为细胞质定位感染，而模拟孔继续收缩。综上所述，这些结果表明hiPSC CMs易受ACE2介导的SARS-CoV-2感染和下游有害细胞病变的影响，SARS-CoV-2可能通过选择细胞器进行病毒蛋白翻译，在hiPSC CMs内的不同核周位置复制，SARS-CoV-2感染可显著降低hiPSC-CMs的收缩功能。

　　SARS-CoV-2感染的hiPSC-CM的转录分析：

　　用0.1 MOI SARS-CoV-2感染hiPSC-CMs 72小时后，通过RNA测序进行转录组学分析。在绘制感染hipscms的基因组读数后，超过50%的图谱读数来自SARS-CoV-2基因组，进一步表明在感染的hiPSC-CM中有活跃的SARS-CoV-2病毒基因组复制。*显著的表达变化是CXCL2，它编码一种已知在SARS-CoV感染过程中转录上调的免疫细胞因子。同样，感染样本中的免疫调节剂（如白介素）和抗病毒应答途径基因（如OAS3）也显著上调。在感染的样本中，心肌细胞标志物TNNT2和TNNC1的表达以及与氧化磷酸化相关的线粒体基因（如CKMT2）的表达均显著降低，该基因编码肌酸激酶。值得注意的是，在SARS-CoV-2感染的hiPSC-CMs中ACE2表达显著下调，这与先前检测SARS-CoV心肌感染的报道一致。基因途径分析证实与线粒体功能，氧化磷酸化和心脏功能有关的转录途径下调，而转录上调的途径包括对有机物的反应，免疫系统过程和凋亡。这些结果表明SARS-CoV-2感染诱导了hiPSC-CMs与细胞代谢和免疫反应有关的基因途径的显著转录变化。

　　讨论：本研究结果证实，人iPSC衍生的心肌细胞易受ACE2介导的SARS-CoV-2直接感染，并且病毒可能在这些细胞中诱导有害的细胞病变。MOI为0.1时，hiPSC-CM在感染72小时后会发生细胞病变作用。推测该病毒是通过ACE2受体进入细胞的，该受体在本研究中由hiPSC-CM表达。ACE2受体抗体能够显着抑制病毒蛋白的表达，复制和细胞死亡。尽管使用了ACE2抗体，细胞仍然容易受到感染，这提示了SARS-CoV-2内在化的潜在替代机制。对SARS-CoV-2的两个组分，即独特的dsRNA中间产物和负责病毒进入和病毒粒子组装的“棘突”衣壳蛋白进行免疫染色，结果表明这种新型冠状病毒可以进入hipscms释放其RNA，并劫持宿主hiPSC-CM的翻译机制，产生新的病毒成分。据推测，hiPSC-CM中病毒载量的增加激活了细胞凋亡事件。表现在细胞形态的改变，裂解的caspase-3的增加和细胞死亡基因的激活。hiPSC-CM收缩力发生了功能性改变，使细胞停止跳动。在CVB3感染的hiPSC CMs中，也观察到类似的钙处理和收缩力的显著变化。此外，SARS-CoV-2在感染的hiPSC-CM中诱导了广泛的转录变化。

　　针对COVID-19，人们提出了多种抗病毒方法，从重组小分子，如核苷类似物或病毒聚合酶抑制剂，到新型抗体和反义寡核苷酸，目前正在进行体外和临床试验。HiPSC-CMs可作为心脏特异性辅助细胞，用于任何旨在抑制SARS-CoV-2增殖的药物的体外临床前疗效研究。鉴于某些现有的COVID-19药物治疗表现出这些靶向心脏毒性，还可以在临床前开发中用于检查抗病毒化合物引起的心律失常和QT间隔延长。