神经精神药理学模型 中国实验动物信息网 2020-12-11 1303

　　简介：尽管神经精神疾病的患病率很高，但其病因和分子机制仍不清楚。斑马鱼在神经药理学研究和体内药物筛选中越来越被用作强有力的动物模型。总的来说，这使得斑马鱼成为一个有用的工具，用于药物发现和分子途径的鉴定。在这里，我们讨论人类神经精神疾病和药物诱导表型的斑马鱼模型。除了涵盖广泛的大脑疾病（从焦虑和精神病到神经退行性变），我们还总结了斑马鱼遗传学和小分子筛选的*新进展，这显著增强了疾病模型和新药物靶点的发现。

　　斑马鱼作为一种新兴的动物模型：广泛和衰弱的神经精神疾病的机制不太清楚，往往缺乏有效的治疗方法。临床相关生物标志物的鉴定、潜在的神经生物学机制以及精神病理学的遗传和环境因素是发现有效治疗方法的关键步骤。虽然啮齿类动物的人脑疾病模型一直被用于这项工作，但它们往往被高成本和实验效率低下所阻碍。斑马鱼*近作为一种广泛的人类大脑疾病的强大动物模型受到了关注。斑马鱼是一种小型、低成本、可遗传驯化的水生脊椎动物，与人类具有高度的形态、生理和遗传同源性。基因表达数据库和斑马鱼大脑图谱也可用于探索与神经精神疾病相关的大脑区域的基因组学和神经解剖学。对斑马鱼的人类条件进行建模可以发现潜在的治疗靶点及其潜在的分子相互作用。例如，在*近的一项研究中，一种突变的mtdp-43斑马鱼发现了亚甲蓝（mb）的治疗潜力。这是通过分析各种化合物改善肌萎缩侧索硬化（ALS）样表型的疗效发现的。同样，mtdp-43突变斑马鱼存在短的、异常分支的运动轴突，氧化应激增加，逃逸反应异常。给予MB（一种神经保护剂）可以纠正游动和轴突表型，同时减少由于未折叠突变蛋白积聚而产生的内质网（ER）应激。在G93A-mtsod1转基因小鼠模型中，将ER应激作为ALS药物治疗的潜在靶点，促使进一步测试几种相关药物的疗效，从而确定和重新定位经批准的高血压药物gunabenz，作为ALS的潜在新治疗。斑马鱼突变模型在确定新的ALS治疗方案中起着关键作用。*近在斑马鱼身上发现的造血干细胞（hsc）的两个调节剂，现在已经成为病人的治疗方法。*初对斑马鱼中近2500个小分子的筛选确定了35条上调重要hsc基因runx1和c-myb的“线索”，其中10条调控前列腺素通路，表明它参与了hsc调控。其中一个有效的候选物，16,16-二甲基pge2（dmpge2），接下来在小鼠模型中进行测试，结果表明它可以增加移植的hsc的数量。随后使用灵长类动物血液模型进行的临床前测试取得了成功的结果,允许药物进入批准的一期临床试验。.这些研究*近在白血病患者中取得了积极的结果，并证明了治疗的安全性，使其进入二期临床试验。无论是幼体还是成年斑马鱼，都是非常适合实验、药理学和遗传操作的临床前体内模型。由于其透明度高、体积小，斑马鱼幼虫尤其适用于神经活动的光学操纵和成像，以及分子药物靶点和候选基因的大规模高通量筛选。随着基因组编辑技术和自动化3D行为表型的*新发展，斑马鱼成为研究基因型-表型和基因型-药物-表型关系的理想模型。此外，斑马鱼在母体外发育，性成熟快（约90天），在实验室中存活约4-5年，可直接、方便地分析其致病轨迹。作为幼虫模型的补充，成年斑马鱼表现出与认知、奖赏、社会行为和效果相关的复杂行为。大鼠和小鼠是目前*常用的研究大脑正常和异常功能的动物；2015年发表的所有神经科学论文中，近1/3使用啮齿动物模型，而其他动物模型（包括斑马鱼）的使用率则低于11%。然而，斑马鱼出版物的增长速度比任何其他模式生物都要快，而且这种生物的实验工具和资源越来越可用。斑马鱼作为一种需要跨多个领域验证的新动物模型，在高通量表型、基因和药物筛选方面具有越来越大的效用，因此在神经精神药理学和药物发现研究中越来越有用。

　　斑马鱼中枢神经系统：斑马鱼中枢神经系统的总体结构、神经解剖特征和细胞形态与哺乳动物的相似。杏仁核在临床焦虑症、社会焦虑症和药物滥用中病理学上过度活化。斑马鱼内侧眼睑显示fos蛋白表达增加，这是在急性服用d-安非他明和在条件位置偏好（CPP）分析中的寻药行为期间神经激活的一种测量，共同支持斑马鱼内侧大脑皮层作为哺乳动物杏仁核的同源结构的作用，在进化上具有调节关键行为的保守功能。通过成像方法观察中枢神经系统的活动是辨别大脑是如何促进正常和异常行为的重要步骤。斑马鱼幼体的小尺寸和光学透明性使得高分辨率活体成像和操纵行为活跃动物的神经活动成为可能。例如，斑马鱼幼体行为的神经元活动的成像是通过表达基因编码的钙指示剂并使用光片显微镜记录整个大脑的活动来实现的。斑马鱼幼体的光遗传学神经调节对于研究与大脑疾病相关的潜在行为的神经回路特别有用。通过表达包括沟视紫红质-2和卤视紫红质在内的光遗传执行器，已经成功地激活了行为幼体斑马鱼的神经元兴奋和抑制靶向神经元种群。迄今为止，斑马鱼的视觉遗传学研究主要集中在几种简单的行为上，如逃跑、运动和感官处理。然而，斑马鱼的光遗传学神经调节有助于未来的研究建立复杂的人类神经精神疾病的强大模型。此外，成年斑马鱼的大脑较大且不透明，因此对其神经活动的成像更具挑战性。以碘为对比剂的对比增强X射线显微计算机断层扫描技术*近已应用于成年斑马鱼，这为完整动物的斑马鱼大脑解剖提供了三维可视化。光学相干断层扫描*近也被用于成年斑马鱼体内，以非侵入性方式生成高分辨率的实时横断面图像，然后在3D中重建。神经化学一般在脊椎动物中是保守的，因为它们共享主要的神经递质、受体和转运体。斑马鱼对主要的药物敏感，如精神兴奋剂、阿片类药物、乙醇、致幻剂、抗焦虑药、抗抑郁药和抗精神病药。斑马鱼主要神经递质系统的时空分布也与哺乳动物相似，在斑马鱼中对谷氨酸、GABA、乙酰胆碱、多巴胺、5-羟色胺、去甲肾上腺素和组胺有很好的描述。例如，除d5受体外，斑马鱼的多巴胺系统的主要通路和受体亚型均存在于斑马鱼体内。*近比较了斑马鱼和人类的d1-d4受体的氨基酸序列，发现d1和d3的结合位点有100%的氨基酸同源性，d2和d4受体有85-95%的氨基酸同源性。作用于多巴胺系统的药物产生类似的表型，由于多巴胺拮抗剂或去除剂损害运动，激动剂可预测地增加斑马鱼运动，与啮齿类动物相似。多巴胺激动剂阿扑吗啡对斑马鱼幼虫的游动距离产生U形剂量-反应关系，低剂量增加中心停留时间（抗焦虑作用）和高剂量增加趋化性（抗焦虑作用）。越来越多的证据表明神经内分泌系统在各种脑疾病中的变化，包括抑郁、焦虑、成瘾和阿尔茨海默病（AD）。激活斑马鱼的神经内分泌下丘脑-垂体-神经元间轴（hpi），释放皮质醇，作用于糖皮质激素受体（gr），类似于人类的下丘脑-垂体-肾上腺（hpa）轴。斑马鱼的神经内分泌系统很容易通过实验、药理学和基因操作进行调节，并且鱼皮质醇可以通过各种侵入性和非侵入性方法进行取样。成年斑马鱼GRS357突变体gr基因的遗传突变通过取消gr与皮质醇结合的转录活性来破坏负反馈和皮质醇信号传导。

　　主要中枢神经系统疾病的斑马鱼模型:如前所述，非人类动物（如斑马鱼）在模拟大脑疾病方面的一个明显优势是它们对实验、遗传和药理学操作的适应性。此外，斑马鱼的行为表型、遗传因素和药理学敏感性通常与啮齿动物大脑疾病模型和人类临床人群的报告相似。

　　抑郁和焦虑：压力是发展情感障碍的常见危险因素，包括严重的抑郁症和焦虑症。在哺乳动物中，应激反应主要由下丘脑、垂体和肾上腺之间的相互作用介导，这些共同形成了hpa轴。长期的应激和hpa轴的过度激活有可能降低gr的表达，*终降低适应和应对应激事件的能力，从而引发抑郁症。在啮齿类动物中，利用早期生活和成年应激以及药理学干预、选择性育种或基因工程对抑郁进行了广泛的建模。一些标志性的抑郁症状（如自卑和情绪低落）在动物身上很难评估，因为它们不能清楚地表现出自我意识。相比之下，其他表型的评估，包括无核细胞减少症，共病焦虑或睡眠和神经内分泌紊乱，可以很容易地在动物身上建模。在斑马鱼中，长期使用不可预测的慢性轻度应激源（UCMS）可诱发抑郁样状态。暴露于7-14天的UCMS中的成年鱼表现出运动减少、浅滩行为改变和体色改变。当应用于社会隔离状态下生长5个月的斑马鱼时，UCMS会增加新型水箱测试中的焦虑样行为。UCMS对探索性和群体/浅水行为的影响可通过氟西汀（一种SSRI）和苯二氮卓类抗焦虑药溴马西泮逆转。几种关键的促炎分子，如TNFα、IL-6和COX-2，在斑马鱼UCMS 7天后受到不同的调节。COX-2转录在复发性抑郁症患者中更高，并被假设为对认知功能、情感性和突触内稳态产生负面影响。精神药物（氟西汀、溴西泮和去甲替林）治疗可降低IL-6和TNFα的表达，突出了该模型对已建立的临床活性抗抑郁药的敏感性。其他药物干预，如利血平的使用，会对斑马鱼产生类似抑郁的反应，包括社交退缩、运动迟缓和皮质醇升高，这些都与抑郁症的临床症状相似。几种遗传模型已被用来研究斑马鱼的抑郁症。例如，具有突变gr（gr/s357）的斑马鱼幼虫表现出较高的生理反应（例如全身皮质醇水平较高）和功能失调的hpi轴，与人类观察到的效果相似。焦虑症是一种使人衰弱的精神疾病，终生患病率约为30%，高于任何其他精神疾病。焦虑症有几种类型，包括惊恐障碍、创伤后应激障碍、广泛性焦虑障碍和特殊恐惧症。焦虑症的标志性症状是对感知到的威胁做出压倒性的、夸大的担忧，从而显著降低患者的生活质量和工作效率。焦虑症的*种治疗方法通常是SSRIs或认知行为疗法。对这些治疗没有反应的患者随后会服用选择性去甲肾上腺素再摄取抑制剂（SNRIs）或三环抗抑郁药。然而，snris或三环类药物增加了耐受性和依赖性的风险，从而限制了它们的使用。此外，尽管存在许多治疗焦虑症的方法，大约30%的患者没有改善。这就需要确定和开发在疗效和耐受性方面没有这些限制的治疗方法。开发新的治疗方法的问题之一是确定生物化学靶点、遗传变异或疾病发病的作用机制，这表明需要动物模型。斑马鱼模型尤其适用于高通量抗焦虑药物筛选。斑马鱼幼虫在受精后3天内孵化出来，5 dpf能够使其膀胱膨胀，并产生广泛的行为。例如，呆在竞技场外围（触角运动）反映出焦虑样行为，并在暴露于焦虑刺激物或药物后增加。在明-暗测试中，鱼可以自由探索明亮的光和暗的沙洲，但当斑马鱼在黑暗中花费更多时间时，这表明有一种焦虑样反应，这种反应可能受到抗焦虑或抗焦虑治疗的双向影响。斑马鱼焦虑的遗传模型也可用，包括囊泡单胺转运体2（vmat2）的敲除，在社交退缩和探索减少的情况下，产生一种焦虑样的形象。

　　癫痫：全世界约5000万人患有癫痫，其特点是反复痉挛/癫痫发作、行为障碍、病理神经活动和内分泌功能障碍。癫痫可在幼斑马鱼和成年斑马鱼中建模（主要通过服用惊厥药物和基因修饰），并通过各种行为和生理终点进行评估。成年斑马鱼癫痫样状态的特征行为是多动、游泳不稳定、身体姿势丧失、痉挛样螺旋游泳和中枢神经系统放电。斑马鱼的实验性惊厥可由急性咖啡因（250 mg/l）、戊四唑（PTZ，2.5 g/l?）和皮罗毒素（100 mg/l）诱发，导致多动、环行/螺旋游泳、痉挛和全身皮质醇水平升高。这些症状在幼体和成年斑马鱼体内都被抗癫痫药物抑制，使人们能够发现更有效的治疗癫痫的方法。例如，ptz给药不仅能诱发特征性癫痫发作，而且伴随着c-fos和npas4的快速转录，与哺乳动物癫痫发作时观察到的反应相似。

　　精神病:精神病表现为认知、影响、运动活动和社会行为的紊乱，常伴有异常的谷氨酸信号。MK-801是一种有效的NMDA拮抗剂，用于啮齿动物、斑马鱼和其他动物模型的精神分裂症模型。同样，脉冲前抑制（ppi）是指当在惊吓刺激前出现微弱的非惊吓反应时，惊吓反应的衰减。精神分裂症患者PPI受损，可通过抗精神病药物治疗来挽救。ppi在斑马鱼幼体中可靠地被复制，包括目前可获得的ppi降低的遗传突变体。总的来说，斑马鱼的神经通路和惊吓反应的相似性证明了它们作为发现抗精神病药物和调节基因的平台效用。

　　阿尔茨海默病:AD是一种渐进性神经退行性疾病，导致认知缺陷、妄想、幻觉以及情绪和行为的变化。AD的标志性症状之一是神经纤维缠结和淀粉样β斑块的发展。有两大类AD：偶发性AD（65岁以上发展）和家族性AD（FAD）.散发性AD占所有AD病例的95%以上，与载脂蛋白Eε4等位基因有关。这个基因想对应斑马鱼的是APOE。早发FAD是遗传性的，与早老素1（psen1）、早老素2（psen2）和淀粉样βA4前体蛋白（app）基因、斑马鱼psen1、psen2、appa和appb基因的同源基因突变有关。斑马鱼对研究AD的病因，特别是缺氧作为一种假定的危险因素的作用，也具有重要的价值。在低氧条件下，线粒体可能释放增加氧化应激的自由基。在斑马鱼体内，通过降低水氧水平或通过叠氮化钠的化学模拟，很容易再现缺氧状态。与人类相似，幼体和成年斑马鱼的低氧条件上调了几个与AD相关的基因，包括SEN1、PSEN2、AppA、AppB和Bace1。

　　肌萎縮性側索硬化症：ALS是一种影响大脑和脊髓运动神经元的进行性神经退行性疾病。斑马鱼是研究脊髓回路功能和功能障碍的一个特别有吸引力的模型，因为在生命的早期阶段视觉是透明的，而且斑马鱼脊髓和人类之间有高度的功能和解剖相似性。与AD相似，有两种广泛的ALS类型：家族性和散发性ALS。大约10%的ALS病例是遗传的。ALS的病因尚不清楚，导致ALS的基因突变具有高度变异性。然而，SOD1是与ALS相关的*容易理解的基因，SOD1基因突变占家族性ALS病例的20%。斑马鱼幼虫过度表达突变SOD1具有异常的神经肌肉连接（NMJ），随着鱼的成熟而恶化。幼虫突变鱼的NMJ体积逐渐减少，强迫游泳试验表现较差，对重复刺激的反应降低。总之，这表明肌肉的神经输入存在缺陷，而不是肌肉固有特性的缺陷。通过热休克应激反应（hsr），斑马鱼也可以早期识别致病过程。hsr机制可修复应激细胞中受损的蛋白质，是监测细胞扰动的有用工具。在含有hsr报告基因（hsp70-dsred）的sod1突变斑马鱼中，荧光促进疾病定位并在整个大脑中传播。这种方法也被用于识别神经保护化合物和生物靶点，以改善尚未完全了解的早期疾病过程。除了斑马鱼在监测ALS症状进展中的作用外，遗传突变体和药理学模型也有助于识别这种疾病的分子机制。例如，斑马鱼C9ORF72的功能丧失导致运动神经元轴突退化，并伴随着幼体斑马鱼游泳速度和运动能力的降低。

　　斑马鱼对中枢神经系统药物类的敏感性：斑马鱼和哺乳动物神经递质系统有充分的相似性，这有助于斑马鱼模型显示出相似的药理学和对各种中枢神经系统药物的敏感性。以特定种类的神经活性药物为例，我们将进一步说明斑马鱼模型的这一方面及其与寻找新的治疗方法的相关性。

　　抗癫痫药物：PTZ是啮齿动物和斑马鱼中*广泛使用的惊厥药之一，能产生大量已知抗癫痫药物不同程度抑制的强效癫痫表现型。小分子筛选*早可在2 dpf时在斑马鱼身上进行，潜在的治疗效果不仅通过行为测试进行评估，还通过监测神经反应进行评估。暴露于PTZ会增加c-fos的表达，而c-fos的表达会被典型的抗惊厥药、抗炎药、天然和合成类固醇、抗氧化剂、血管扩张剂减弱。然而，尽管这些药物可减轻PTZ诱发的癫痫，但其作用机制仍不清楚。除PTZ外，其他药物在斑马鱼体内也会诱发癫痫样状态。凯尼酸（KA）是啮齿动物常用的惊厥药，对斑马鱼也有类似作用。谷氨酸受体拮抗剂可减少KA诱导的癫痫发作，强调斑马鱼模型在研究谷氨酸兴奋性神经传递中的作用。例如，氯米唑（一种组胺受体拮抗剂）对SCN1lab斑马鱼（一种由SCN1a突变引起的Dravet综合征模型）的基因诱发癫痫有效，该模型具有对主要抗癫痫药物不敏感的自发癫痫。

　　抗精神病药：*代（典型）抗精神病药物是多巴胺D2受体的高亲和力拮抗剂，是治疗精神病*有效的药物。然而，它们会产生严重的副作用，包括震颤、偏执和焦虑。与典型抗精神病药物相比，第二代“非典型”抗精神病药物对D2受体的亲和力较低，副作用较少。然而，仍然需要对精神病进行新的治疗，斑马鱼模型在这方面非常有用。例如，服用MK-801会导致运动过度[类似于精神运动激动，这是精神分裂症以及社会和认知缺陷的特征性症状。MK-801诱导的运动效应被典型（氟哌啶醇）和非典型（奥氮平和舒必利）抗精神病药逆转。然而，暴露于MK-801的鱼类在抑制性回避任务中表现不佳，其社会和认知缺陷通过非典型的抗精神病药物得以恢复。

　　镇静剂：镇静剂通常用于治疗焦虑症，产生焦虑减轻、抑制和镇静作用，主要调节组胺能、GABA能和肾上腺素能系统。斑马鱼与哺乳动物GABAA和GABAB受体亚单位和组胺H 1受体有相似之处，对多种镇静剂高度敏感。高剂量的氯二氮氧化物显著降低游泳速度，而地西泮对焦虑有双向作用。低至中等剂量，减少底部居住，高剂量可导致镇静。在斑马鱼体内，长期暴露于地西泮后2周会产生类似的撤退症状，包括在明暗偏好任务中的焦虑。

　　斑马鱼小分子及遗传筛选研究进展：自动化和高通量筛选展望：斑马鱼模型非常适合行为、基因组和蛋白质组学测试，因为它们结合了相对简单的神经和从睡眠到焦虑的多种行为过程的行为复杂性。定制和商用视频跟踪软件可以记录各种斑马鱼行为测量，包括速度、行驶距离、地点偏好和特定模式。斑马鱼视频跟踪的自动化可以同时记录多个行为结果，消除了每次测量新结果时重复实验和/或手动观看和重新观看视频的需要。还可以记录斑马鱼的社会群体。幼体斑马鱼允许记录更多的动物（例如96只），同时跟踪它们的游泳模式。在这个迅速增长的斑马鱼现象学领域中，技术进步的另一个优势是药物管理的自动化和刺激暴露的计算机化，例如在药物成瘾或恐惧调节范例中，它共同提高了测试程序的标准化，并提供了有效的数据收集、增加了吞吐量和数据再现性。由于斑马鱼的多个行为参数可以在3D中监控，因此，斑马鱼更易于进行高通量的体内筛选。例如，X、Y和Z游泳轨迹可以通过两个摄像头进行跟踪，生成两个集成的二维轨迹文件，以生成游泳模式的三维跟踪，这有助于识别独特的药物诱导表型特征。行为识别的进展允许对行为表型进行更详细的体内分析。例如，能够区分斑马鱼尾巴、身体中部和头部的软件能够很好地量化运动，并解释诸如追逐或咬、追逐等复杂行为。这些方法在使用作用于多个靶点的药物的多药理学研究中特别有用。由于许多精神疾病与多个神经递质系统的缺陷有关，并具有多基因病因，斑马鱼筛选变得尤为重要。计算技术，如层次聚类或相似集合方法，也有助于识别目标命中率和预测目标与精神活性化合物的相互作用。将行为表型和计算技术相结合，有助于开发和发现新的医学目标，包括在二维或三维跟踪中对单个目标化合物进行体内行为表型，产生其独特的游动轨迹，识别产生所需行为表型的化合物，并利用预测其生物目标的算法进行后续深入分析，以生成目标组合的假设。

　　斑马鱼遗传模型研究进展：如前所述，基因操作在动物研究中至关重要，以确定与疾病病因相关的候选基因。通过注射吗啉修饰反义寡核苷酸（MOS）或小干扰RNA（siRNA）进行功能丧失研究，实现短期遗传调控。MOS靶向特异性翻译抑制剂并有效降低基因表达。RNA干扰（RNAi）是RNA分子抑制靶向mRNA分子翻译的过程。这些方法在靶向特定基因和产生改变的表型方面表现出有效性，尽管*近，MOS的有效性受到质疑。突变斑马鱼的发育提供了一个更稳定的行为表型，因为它不产生特定基因的敲除，而是完全消除目标基因产物。突变体是通过逆转录病毒插入突变产生的，其中DNA碱基对整合到生物体的现有DNA中或通过化学突变产生。化学诱变包括交配前几周将雄性斑马鱼暴露在甲基化剂乙基亚硝脲下，为了让突变在精原细胞成熟为精子之前就固定下来。突变斑马鱼和变形斑马鱼被广泛应用于研究中，并提供了对特定受体和生物目标的作用和重要性的更深入的理解。例如，在开发自闭症的突变模型时，发现了一组具有大基因靶点的高度活跃的基因，从而更深入地研究了与基因缺失和重复相关的功能变化。此外，先前未知的基因靶的大小被阐明，以便在高等脊椎动物和哺乳动物中进行靶向分析。

　　结论：神经精神疾病折磨着全世界的人类，并造成巨大的个人和社会成本。长期以来，动物模型一直被用于神经心理学研究，以更好地了解人类疾病状态，并在识别生物和分子靶点方面发挥关键作用，目的是开发更安全和更有效的治疗方法。斑马鱼是一种很有前途的新动物模型，它继续为中枢神经系统疾病的病因提供重要的见解。斑马鱼和哺乳动物大脑关键区域的同源性强调了斑马鱼模型在神经行为学和神经心理学研究中的应用。此外，斑马鱼和哺乳动物之间的神经通路的保守允许对发现进行双向翻译。目前的遗传工具、跟踪技术和统计算法有助于加深对分子途径的了解，开发新化合物或重新利用现有药物。结合斑马鱼对已知的抗焦虑药、抗精神病药和其他中枢神经系统药物的高敏感性，这为研究人员提供了一个全面的模型有机体，能够识别药物治疗的分子靶点，并对其假设进行实证检验。