金黄色葡萄球菌败血症模型 中国实验动物信息网 2020-12-06 607

　　背景：肝脏作为脓毒症的一个多功能器官，在脓毒症中起着核心作用。人类的重症监护病房（ICU）内，胆汁淤积性肝功能障碍是一种常见的发病率，出现如感染、败血症、大手术、输血，使用抗生素和其他药物的肝毒性的副作用。诊断通常基于血清胆红素浓度的增加，通过转氨酶谷草转氨酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（AP），乳酸脱氢酶增加和/或低蛋白血症发生来支持。持续性高胆红素血症与金葡菌败血症患者死亡率增加有关。脓毒症相关肝功能障碍的发病机制尚不清楚。之前我们已经进行了两相关脓毒症模型，实验猪接种血源性金黄色葡萄球菌，研究时间长达48小时。从接种到安乐死的观察期间，猪是处于清醒状态的。脓毒症的临床症状包括体温升高，中性粒细胞， C-反应蛋白（CRP）和白细胞介素-6（IL-6）增加，血清铁降低。增加血液的高凝状态，血小板数量的减少表明凝血系统功能障碍，而特别值得注意的是肝功能异常是间接表明高胆红素血症与肌酸激酶水平正常AST一起增加（CK），以及纤维蛋白从肝内小血管渗出。从肝组织中分离到少量的细菌，，表明肝脏的影响是全身炎症反应的一部分，而不是肝脏局部感染的结果。这些观察结果导致了实验性金黄色葡萄球菌败血症猪出现肝功能障碍的假设。接种血源性金黄色葡萄球菌48小时后，通过引入半乳糖消除能力测试（GEC），确认和量化肝功能不全的存在。动物福利与模型稳健性师研究设计的一个挑战，一些猪接种过程呼吸暂停和中心脏骤停。其他猪实施安乐死之前由于严重的临床疾病，即发展为急性呼吸功能障碍，重症肺炎。在此模型中，接种浓度对脓毒症的严重程度有一定的指导作用。我们利用这一观察结果，形成了本研究的第二个假设，即金黄色葡萄球菌的输注速率为诱发临床疾病的程度。简言之，在我们预先定义的人道主义终点的范围内，不能重建肝功能障碍的迹象，因此，在有意识猪败血症模型中，很难建立科学目标和动物福利之间的平衡。

　　方法：动物：6头雌性，杂交猪。六只猪未金黄色葡萄球菌。基于标准的血液学和生化结果以及对日常的8–19天的适应期，猪被认为是临床健康的。在接种日体重（BW）为30‒36公斤。

　　建立永久性静脉输液通路：接种前1至3天，猪术前结合以下药物肌肉注射：0.83毫克/公斤体重唑拉西泮麻醉和0.83毫克/公斤体重噻环乙胺，0.83毫克/公斤体重甲苯噻嗪，0.83毫克/公斤体重氯胺酮，和0.17毫克/公斤体重布托啡诺（10毫克/毫升）。转移时，静脉注射丙泊酚。永久性中心静脉导管无菌插入每个耳朵的耳缘静脉，并引导进入颈内静脉。将导管固定。为了防止导管凝固，用肝素（1000毫升/毫升）沉积2.5 - 3.5毫升盐水作为锁定溶液。猪恢复麻醉后被允许分别饲养在生物安全2级的饲养笼内。

　　接种与实验设计：在接种程序后1 - 3天建立静脉输液，使用术前一样的用药再次麻醉猪。猪的气管插管，（100%氧、0.5–1升/分钟）进行超声心动图和脉搏血氧饱和度监测。实验连续进行了三次，前两轮接种一头猪金黄色葡萄球菌，接种一头生理盐水，第三轮接种两头猪。金黄色葡萄球菌猪特定菌株通过左耳静脉导管注入四只猪，悬浮在0.9% NaCl，剂量为1×108 cfu／kg BW。1、2、3轮输液剂量分别为30, 10和20毫升，使用一个固定的输注速率3 mL/min。输注时间为10，3.33，和6.66分钟，分别对应1×107, 3×107和1.5×107 CFU /分钟/公斤体重接种剂量，两个对照猪被注入体积盐水（0.9%氯化钠）对应平行接种。

　　接种后观察期：接种完成后，猪可以从麻醉中恢复过来。从右耳静脉导管可以重复采血和静脉注射止痛剂。恒定灌注等渗盐水（0.9%氯化钠，3毫升/小时，只有在采血或输注止痛药时才中断。临床检查（如体温测量、听诊、血氧饱和度测量）只在临床症状判断为恶化或痛苦时才进行。在整个实验研究期间，0.01‒0.02毫克/公斤体重丁丙诺啡静脉注射接种猪和对照猪。

　　人道终点：人道终点是根据我们组先前进行的脓毒症研究所使用的终点。进一步阐述了减少动物福利评估的主观性。简言之，终点包括：（1）严重的呼吸困难症状，定义为猪不能保持血氧饱和度90%以上。（2）不能起立和/或移动。（3）标志性脑炎，如眼球震颤、麻痹，或头部倾斜。

　　血液测定：基线血标本（B）在接种前1～3天从静脉导管中取出。在接种前开始（0小时PI），其余的研究期间每隔6小时采血。对血清进行临床化学分析。反应蛋白是用树枝状大分子偶联胞苷二磷酸胆碱夹心酶联免疫吸附分析，血清淀粉样蛋白A（SAA）是用夹心ELISA测定。并在以下时间点PI：0、6, 12, 24，36和48小时进行细菌培养。

　　半乳糖消除能力试验：半乳糖（0.5克/千克体重，12%溶液）通过右耳静脉导管输注超过5分钟。在开始输注15 - 60分钟后，在五分钟的间隔内获得肝素稳定的动脉血液样本。取样30 min内，对血液进行离心（4°C ，2500转，10分钟）和等离子体保持在−20°C直到分析。注射半乳糖4小时后收集尿液。

　　安乐死：在完成测试后，注射过量丙泊酚（3–6毫克/公斤体重）立即腋窝放血后立即对猪实施安乐死。

　　病理学和细菌学：从肝淋巴结和五个预先定义的区域获得的肝。标本均经10%福尔马林固定24 h，常规处理后，切成3–4µm.切片用HE染色后进行评价。

　　结果：接种猪案例一（1×107 CFU /分钟/公斤体重；输注10分钟）：在细菌输注时只有轻微的心动过速（心率从60增加到每分钟90次）。猪在*初的6小时里躁动不安；此后就卧着不愿意站起来。变得厌食，但仍愿意喝水。四肢变冷。这只猪完成了研究，没有达到任何人道的终点。通过增加身体温度显示为脓毒症，菌血症和中性粒细胞，同时增加IL-6、CRP、SAA、降低铁。肝血参数无显著变化，但总胆红素血药浓度在24～42小时之间增加。

　　案例二：（3×107 CFU /分钟/公斤体重；输注3.33分钟）：除了轻度心动过速外，细菌输注过程中出现短暂的自发心律失常发作。与其他猪相比，这头猪表现出更为早期和严重的临床症状，也就是说，它变得麻木，肌肉震颤。30 h后，这头猪已经不再能站起来了，并被实施安乐死，根据人性化终点：“无法起床和/或移动。“升高体温表明脓毒症、菌血症和中性粒细胞，同时增加IL-6、CRP、SAA、降低血清铁。此外，AST水平在6小时达到峰值（是基线值5倍），并保持升高。CK水平也有类似的模式。

　　案例三和四：（1.5×107 CFU /分钟/公斤体重；输注6.66分钟）：临床上，猪的行为方式类似案例1。在研究期间，两猪都摄入少量的饲料，没有达到人道终点。接种猪的体温升高表明脓毒症和菌血症和中性粒细胞，同时增加IL-6、CRP、SAA、降低血清铁。除了肝胆红素有短暂增加外，其他肝参数不受影响。

　　结论：在我们预先定义的人道主义终点范围内，不能重建肝功能障碍的迹象。科学目的和动物福利之间的平衡是不可行的，我们发现很难再使用有意识猪脓毒症模型。我们建议将此模型作为一种长期麻醉模型重新建立，以便建立一个与脓毒症相关的翻译模型。