在动物实验室中,生命小鼠和大鼠可谓星辰,成功的老鼠模型可称为“生命科学的好帮手”。许多人可能想自己设计或了解条件基因敲除小鼠。
条件敲除鼠标设计利用Cre/LoxP或Flipe/Frt原理。这些都是位点特异性重组酶系统。这里以Cre/LoxP系统为例。例如,将loxP序列放置在目标DNA序列的每个末端以敲除并获得flox(flankedbyloxP)小鼠。将Flox小鼠繁殖到特异性表达Cre的小鼠,或条件性剔除小鼠,后者可在特定细胞中敲除靶基因。此外,与控制Cre表达的其他诱导系统(例如CreERT2)结合使用时,它还可以在时间和空间上调节基因。
Cre/loxP系统源自噬菌体,可介导位点特异性DNA重组。该系统包含两个组件。*个是一个34 bp长的DNA序列(LoxP序列),其中包含两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。 LoxP的方向由中心的这八个碱基决定。该LoxP序列是被Cre重组酶识别的位点。一种组分是Cre重组酶。它是由噬菌体编码的343个氨基酸组成的蛋白质。 Cre可以介导两个LoxP位点的重组,并导致两个LoxP之间的DNA序列缺失。如果在组织或细胞特异性启动子下对Cre重组酶cDNA进行了基因工程改造,则可以使用表达Cre组织/细胞的Cre小鼠,也称为Cre工具小鼠。与Flox小鼠交配后,您可以得到条件性剔除小鼠。所谓的Flox小鼠是指在特定基因的特定外显子侧翼的LoxP序列。该序列由LoxP侧翼,也称为Flox小鼠。通常通过靶向载体设计和构建,胚胎干细胞重组,胚泡显微注射以及嵌合小鼠传代获得此类Flox小鼠。这种小鼠与Cre工具鼠标一起繁殖,Cre表达介导两个LoxP位点序列的重组,导致两个LoxP位点之间的序列敲除。使用不同Cre工具在小鼠中的Cre /小鼠表达具有组织/细胞特异性,从而达到了特异性敲除不同组织和细胞中靶基因的目的。上皮细胞,胸腺细胞,T细胞,B细胞,心肌细胞,肠,肺等。
如何设计条件性剔除小鼠?这里描述的设计主要是Flox鼠标的设计。所谓的条件敲除意味着在除某些细胞外的其他细胞中没有异常的基因表达。通常情况下,请勿将LoxP序列置于*个外显子之前。*个外显子通常是启动子。放置LoxP序列可破坏或改变启动子活性。有条件的敲除通常是敲除*初引起移码突变的外显子。在这种情况下,*好不要在起始密码子ATG处敲除外显子。如果不是这样,则该基因可能在ORF中使用ATG编码缺少部分N端序列的蛋白质,该序列可能具有全部或部分野生蛋白功能..选择要敲除的外显子时(外显子两边各有一个LoxP),外显子数不能为3N。否则,新基因pre-RNA无法产生剪接的mRNA移码突变。与野生蛋白相比,产生一种缺少中间序列的新蛋白。当外显子的数目为3N + 1或3N + 2时,敲除该外显子后发生移码突变,并且可以实现基因敲除的目的。在筛选将被敲除的外显子(Floxed)时,通常会在*上游的外显子中筛选适合敲除的外显子。请注意,常见的DNA分析软件无法确定内含子和外显子的边界,因此应仔细检查。超过95%的边界遵循gt/ag边界原则。您也可以使用Ensembl检查该基因的外显子和内含子。该网站上的大多数结果都是正确的。但是,您还需要仔细检查。毕竟,基因敲除小鼠的发育是一个相对较长的过程,需要特别注意。在早期阶段考虑不多。这些原则只是一般主题的考虑因素。特殊情况需要特殊对待。例如,如果您想敲除某个基因的特定结构域,或者该基因的外显子很大,那么即使该外显子具有3N个碱基,您也可以将其剔除掉。 ..