动物模型,胫骨骨癌痛模型 中国实验动物信息网 2020-07-25 3016

　　根据*新研究，大约三分之一的晚期癌症患者会发生骨转移，使骨癌疼痛成为癌症患者*常见的疼痛类型，严重影响其生活质量。影响随着医学的发展，可获得越来越多的骨癌疼痛治疗方法，但是由于短期治疗效果和副作用，不可能理想地控制骨癌疼痛的重要部分。限制新疗法出现的关键是骨癌疼痛的病因尚不清楚。长期缺乏可靠的动物模型阻碍了骨癌疼痛机制的研究和新型镇痛药的开发。直到1999年，Schwei等人首次报道了股骨骨痛的小鼠模型。然后是Medhurst等。建立了全球公认的大鼠胫骨癌疼痛模型。建立模型为了解人类骨癌疼痛的病因和治疗提供了一个极好的工具。然而，在中国，由于各种实验室条件和用于建模的细胞系的限制，骨癌疼痛模型的复制仍然是相关的研究瓶颈。本章详细介绍了改良的Medhurstrat胫骨癌疼痛建模方法。细胞接种后，使用自控方法比较前后疼痛行为的变化，使用X射线和HE染色切片确认骨损伤的发生，并评估测试模型是否成功建立。一系列调查将提供正确的工具。

　　*节实验室设备和试剂

　　一个。实验装置实验装置包括光热尾巴疼痛测试仪，足底疼痛测试仪，倒置显微镜（DMI6000B），自动组织包埋机（ZMN-7803），电动恒温水浴，恒温干燥箱，微波炉，冰箱（ BCD-203），光学显微镜（BX41TF），组织切片器（Leica2135、2145），微量进样器（5μl），移液器（1 ml），无菌控制台。

　　2.主要试剂

　　Gibco胎牛血清，75％乙醇，0.01moL/LPBS，生理盐水，无菌骨蜡，4％多聚甲醛，PBS固定剂，10％，20％，30％蔗糖。 ，冷冻切片包埋剂，切片保护剂，3.6％水合氯醛，0.25％胰蛋白酶，免疫抑制剂，2.5％头孢噻肟钠。

　　3.实验试剂的制备

　　（1）0.01mol/LPBS的制备

　　aCl8g

　　a2HPO4？12H2O3.634g

　　KCl2g

　　KH2PO4g

　　KH2PO4g

　　KH2PO4g

　　KH2PO4g

　　KH2PO4

　　（2）准备一个容量为1000毫升，可容纳约800毫升去离子水的烧杯，并按顺序添加测得的试剂。

　　（3）搅拌玻璃棒使其完全溶解，*后将其稀释至1000毫升。

　　（2）准备0.25％的胰蛋白酶

　　（1）准备一个容量为200 ml的干净，干燥的烧杯。

　　（2）用电子天平称取0.25g胰蛋白酶，并溶于100ml 0.01mol/LPBS中。

　　（3）用0.2μm的滤膜过滤，包装，然后在-20℃的冰箱中存放以备后用。制备免疫抑制剂 250mg 5ml环孢素用生理盐水稀释10倍，制成250mg 50ml，浓度5mg/ml。

　　（4）3.6％水合氯醛

　　3.6 g水合氯醛，称取100 ml蒸馏水，充分混合并密封以备后用。 （5）4％多聚甲醛-PBS固定剂将40g多聚甲醛溶于800ml 0.01mol/L PBS中，溶于60℃的恒温水浴中，并稀释至1000ml。 （6）2.5％头孢噻肟钠将1g头孢噻肟钠在40ml盐水中制成2.5％浓度的溶液。

　　四、实验所需的其他设备

　　（1）实验设备

　　倒置显微镜，恒温水浴，CO2培养箱5毫升注射器，10毫升注射器针头，组织剪刀，螺纹剪刀，弯曲钳，齿形钳，无牙镊子等

　　细胞培养装置

　　密封膜，75％酒精棉球，酒精灯，15 ml离心管，6孔细胞培养板，1 ml无菌移液器吸头，1 ml移液器等

　　第2节实验方法

　　ichi。体外大鼠乳腺癌细胞系MRMT-1培养

　　（1）MRMT-1细胞复苏

　　（1）将预热的培养基放在舞台上。

　　（2）穿着无菌手术衣，手套，口罩，帽子和75％的酒精棉球无菌手套。

　　（3）将桌子上的无菌6孔细胞培养板包装撕开，从饭盒中取出15毫升离心管并放在架子上。

　　（4）取下培养基密封膜，用75％的酒精棉球擦拭瓶口，加热并在离心管中加入9 ml培养基。

　　（5）盖住培养液瓶的嘴和塞子，因为它们太热了。

　　（6）-在-150°C下从冰箱中取出装有复苏细胞的冷冻管，将其插入漂白板，然后在37°C摇动。

　　（7）将解冻的细胞放在桌上，用75％的酒精棉球消毒双手，用75％的酒精棉球擦拭低温恒温器的嘴，加热，打开瓶盖，加热，冻结冻结吸出细胞培养基，将其放入装有9 ml培养基的15 ml离心管中，立即离心，并以1000/min的速度离心10分钟以除去上清液。 （8）接下来，添加12 ml新鲜培养基（血清是来自澳大利亚的血清），混合并接种培养板。用倒置显微镜观察时，细胞均匀漂浮。

　　（9）在5％CO2培养箱中于37℃孵育。

　　（2）细胞通过

　　（1）在倒置显微镜下观察细胞生长，发现细胞占据了整个培养板每个孔的80％至90％，开始。

　　（2）准备实验所需的乙醇和酒精棉球，并将用过的培养液放入培养箱中进行预热。

　　（3）30分钟紫外线灯消毒实验表。

　　（4）戴上帽子，口罩，礼服和手套，将包装并消毒的移液器吸头盒和EP管放在超干净的桌子上，以便立即交付。

　　（5）从培养箱中取出冷冻的细胞培养板和预热的培养基，将它们放在刚刚喷有酒精的干净桌子上，然后用酒精棉签擦拭以进行消毒。

　　（6）从装有培养液的瓶子的嘴上取下密封膜，用酒精棉签擦拭瓶子的嘴和瓶盖之间的连接，然后将酒精灯放在灯的左侧。

　　（7）取下培养板的盖子，放下盖子，提起培养板，与超净工作台表面成45°角，然后用移液器将其固定在每个培养孔的底部，吸出液体并丢弃，用PBS冲洗1接下来，除去PBS，添加0.25％的胰蛋白酶进行消化，盖上细胞，盖紧盖子，在室温下消化2-3分钟。

　　（8）停止用含血清的培养基消化，并轻轻移液以悬浮粘附细胞。

　　（9）将细胞收集在离心管中，并以1000/min的速度离心细胞10分钟。 （10）除去培养基，加入12 ml新培养基制成细胞悬液，并计数细胞。 （11）将细胞悬浮液稀释至2 x 100000细胞/ ml的细胞密度以便接种。

　　（12）在5％CO2培养箱中于37°C孵育。

　　2.骨癌疼痛模型复制

　　参见Medhurst等人报道的建立大鼠骨癌疼痛模型的方法。 （1）选择二十只成年清洁级雌性SD大鼠，将其随机分为两组：假手术组（对照组）和骨癌疼痛模型组（实验组）。

　　（2）在麻醉有效时，将1 ml/100 g的3.6％水合氯醛注入腹腔并固定在仰卧位。

　　（3）修剪左后腿，用碘对皮肤消毒，并铺开无菌盖布。

　　（4）在胫骨上方皮下组织的*薄部分（膝盖以下约5 mm）做一个1厘米的小切口，以清楚地分离皮下组织并小心地露出胫骨。 （5）用10毫升注射针分开局部骨膜，在与手术部位胫骨表面垂直的位置开一个孔，用食指抵抗钻头的力握住胫骨，并弯曲后肢的膝关节。在骨髓腔中，您可以保持身体的突破感在10μl微型注射器中缓慢注入3μl含有

　　（6）3 x 1000细胞的MRMT-1大鼠乳腺癌细胞，并在注射后用无菌骨蜡小心地密封针孔。假手术组注射等量的生理盐水。

　　（7）用生理盐水冲洗伤口并缝合皮肤。 （8）术后抗感染（2.5％头孢噻肟钠）治疗。

　　3.骨癌疼痛模型的评估

　　在不同时间段（手术前一天，手术后一周，每周温度和疼痛检查，手术后四周）大鼠疼痛行为的评估。成都高新区四川大学转型医学中心测试了大鼠下肢的机械压痛和臀部的热痛阈值，在实验过程中保持室内安静），局部组织学和图像变化（手术后4个）通过每周的胫骨X射线检查和HE染色确认模型已复制）成功。

　　（1）大鼠机械性疼痛检测：足底疼痛计重量为20g，刻度为0-25、爪子重量=刻度尺x 20g，分别测量大鼠的左，右下肢，测量下肢。将中心部分放在平台上并开始测量。缓慢移动测试杆，直到压力达到一定阈值。老鼠缩回小腿。记录此时的比例。总共进行了4次测量，每个测试间隔超过1分钟。不计算数据，并且对*后三个数据进行平均。

　　（2）大鼠热痛测试：将光热尾痛测试仪的红外强度设置为80℃，时间阈值为22g。将每只大鼠放在固定器上后，不能立即进行热痛测试。等待约1分钟，然后再开始检测。在测量过程中，将大鼠尾巴的后三分之一放在红外线中。按下开始按钮后，时间开始。当热刺激达到一定阈值时，大鼠的尾巴会摇动，红外光消失。计时立即停止，并读取此时的时间。总共4个测试。测试间隔超过1分钟，不计算*个数据，并平均*后三个数据。

　　第四、使用SPSS 16.0统计软件分析统计方法

　　。数据表示为x-±s，组之间的比较使用方差的单向分析，组内不同时间点的比较使用方差的重复测量分析P\u003c。 0.05表示差异具有统计学意义。

　　第三节实验结果

　　一。疼痛行为的变化

　　如图23-1所示，假手术组和骨癌痛组之间的术前机械止痛阈值没有差异（P\→ 0.05））与手术后7天，14天，21天和28天相比，该组大鼠的术前机械爪退缩阈值显示出轻微的下降趋势，但无统计学意义（P\→ 0.05）。与假手术组相比，骨癌疼痛组的大鼠术后7d，14d，21d，28d明显减少（p\u003c0.05），而与假手术组相比，则显着减少（p\u003c0.05），统计差异（P\u003c0.05）。

　　二。 X射线结果大鼠胫骨的X射线照片如图23-3所示。在注入大鼠肿瘤细胞的一侧的胫骨中有明显的骨破坏，并且骨破坏的程度与建模时间呈正相关。时间越长，损害越大。到第28天，骨破坏加剧，并且骨皮质缺少蠕虫进食。假手术组胫骨的X光片显示没有明显的骨破坏。

　　3.组织学观察

　　第4节经验和注意事项

　　（1）细胞培养过程必须严格无菌，并且必须在超干净的工作台中完成实验工作。这对于细胞恢复和传代非常重要。大鼠手术中的脱发，无菌操作和术后抗感染性疾病对于建立

　　（2）模型至关重要。必须绝对防止手术后感染手术部位，并且当在手术部位发生炎症性感染时，会发生炎症性疼痛，并且会严重阻碍正常结果。 （3）在胫骨上打洞时，请选择皮下组织和肌肉较少的部分，并完全分离皮下组织，骨膜和穿刺区域的骨表面，以免钻头困住软组织。皮下组织和肌肉过多会在分离和暴露过程中造成严重损害，引起疼痛并妨碍正常结果。

　　（4）骨骼表面必须垂直于穿刺处，以*大程度地减少胫骨损伤。否则，胫骨的压缩能力将受到损害。穿刺部位的骨折更有可能发生。 （5）手术后，必须仔细密封无菌骨蜡，以防止肿瘤细胞通过穿孔泄漏。骨髓腔内压力升高是骨癌疼痛的原因之一。肿瘤的向外生长降低了髓腔的压力并减轻了疼痛。这不会导致实验检测。

　　（6）疼痛阈值水平检测属于感觉检测，很容易受到外部因素的干扰。因此，在进行行为疼痛测试时，应让大鼠有一定时间，以保持环境安静并适应放置测试的环境，以便进行检测。 （7）组织固定的质量是影响免疫组织化学结果的重要因素。组织标本应放置在固定液中或分离后30分钟内低温保存，中性甲醛溶液是*佳固定液，固定时间为12-24小时。中性甲醛溶液具有很强的渗透力，固定均匀且组织收缩小，使其成为HE切片或免疫组织化学的理想固定剂。