动物实验,红细胞生成素,红细胞 中国实验动物信息网 2020-09-11 570

　　背景：红细胞（RBC）是血液中*丰富的细胞，对于体内氧气的传输至关重要。出生后，红细胞产生的部位从胎儿肝脏转移到骨髓（BM）和脾脏。在人类中，骨髓是稳定的红细胞生成的主要部位。相反，在小鼠中，除了骨髓外，脾脏在稳态红细胞生成中的作用很小（10％）。在出血和急性贫血等应激条件下，人和小鼠的脾脏在应激性红细胞生成中起主要作用。造血干细胞（HSC）存在于骨髓中，由内皮细胞，成骨细胞和巨噬细胞组成的基质细胞产生的细胞因子和信号调节包括红细胞在内的各种血液系统的分化。 HSCS首先分化为大核红细胞前体细胞，然后形成爆发性红细胞集落形成细胞（BFU-Es），然后形成红细胞集落形成细胞（CFU-Es）。 CFU-es比BFU-es更成熟，在甲基纤维素中培养CFU时形成的菌落小于BFU。 Erislopoetin（EPO）是一种30.4 kDa的糖蛋白，主要由肾脏合成，是红细胞增殖，分化和存活的主要调节剂。在低氧条件下，EPO的产生被低氧诱导的转录因子（HIF）上调。 EPO受体（EPor）主要在CFU-ES中表达，并在红系分化过程中逐渐下调。在EPO与EPORS结合的刺激下，CFUES发育为原始红细胞，然后发展为基球，然后发展为多色红细胞，*后发展为基球。在红细胞分化的*后阶段，网状红细胞被去核，红细胞成熟为循环红细胞。贫血是由红细胞减少，红细胞产生减少，红细胞破坏增加或红细胞寿命缩短引起的。世界卫生组织将贫血定义为女性血红蛋白水平低于12 g/dl，男性低于13 g/dl。除患有遗传性造血疾病的患者外，患有慢性疾病（例如肾脏和心脏病，癌症，炎性肠病，类风湿性关节炎和人类免疫缺陷病毒（HIV））的患者贫血发生率*高。我会。然而，自1998年以来，已经报道了一些严重的副作用，包括由长期注射EPO诱导的中和抗体引起的EPO相关的纯红细胞生成。也有其他副作用，例如高血压，静脉血栓栓塞，中风和死亡风险。当前可用的Erythronspirator（ESA）是由人类细胞或中国仓鼠卵巢细胞产生的EPO的变体。已经开发出新的ESA（例如肽基红细胞生成作用），通过HIF稳定和GATA1抑制激活内源性EPO产生以及EPO基因治疗。但是，这些新方法都不比现有的ESA更有效。我们之前的研究发现，粒细胞集落刺激器（G-CSF）可以将新合成的红细胞募集到外周血（PB）中，以促进红细胞在体外和体外的分化和增殖。是的这项研究进一步调查了G-CSF和EPO对红细胞生成的影响。用G-CSF和EPO处理小鼠后，将BM和脾红细胞生成与流式细胞术进行了比较。我们研究了早期红系前体亚群的刺激和红系前体细胞募集的时间调节。讨论了G-CSF促进红细胞生成的机制。方法：B.木炭杆菌致死毒素（LT）由台湾台北的国防医学中心预防医学研究所提供，并如上所述纯化。 EGFP小鼠[C57BL/6J-Tg（Pgk1-EGFP）03narl]和C57BL6J小鼠购自国家实验动物中心。

　　骨髓和脾红细胞生成分析：C57BL/6J小鼠（雄性，10-12周龄），每天2次IU/grhEPO或55μg/ kg重组人G-CSF我注射了3天。给予相同量的生理盐水作为阴性对照。如上所述分离BM细胞。用50毫升注射器的柱塞研磨脾脏，然后用P1000移液器重悬以形成单细胞悬液。将细胞在含有5％牛血清白蛋白的RPMI-1640培养基中于37℃封闭1小时。随后，将大鼠抗小鼠异硫氰酸荧光素标记的CD71抗体（BioLegend）和大鼠抗小鼠异种球蛋白（APC）标记的ter-119抗体（BD免疫细胞测定系统）在37℃下孵育1小时。用磷酸盐缓冲的生理盐水（PBS）洗涤后，将细胞重悬于1 ml PBS中，并使用Beckman Coulter Gallios？流式细胞仪进行分析。

　　EGFP小鼠红细胞募集流式细胞仪分析：增强型绿色荧光蛋白（egfp）小鼠（雄性，8个月大）每天一次或连续3天每天向尾静脉注入55μg/ kg G-CSF 2IU/gEPO ..*次注射后20、40和60小时从尾静脉抽取外周血。与大鼠抗小鼠APC结合ter-119抗体在37°C下孵育1小时。然后在37°C下用5μmRNA选择性染料F22处理30分钟。用PBS洗涤后，使用Beckman Coulter Gallios？流式细胞仪分析细胞。 EPO和可溶性P-选择素免疫测定法：向C57BL/6J小鼠（雄性，10-12周大）注射55μg/ kg G-CSF进入眼眶，每天一次，连续2天进行EPO免疫测定，5我连续运行了一天。每天进行一次可溶性p-选择素免疫测定。用相同量的生理盐水处理的动物用作阴性对照。首次注射后22、44和66小时，收集PB用于EPO免疫测定。*次注射前0天和*次注射后1-5天进行可溶性P-选择素免疫测定。根据制造商的说明，酶结合免疫吸附量度（ELISA）用于EPO和可溶性P-选择素免疫测定。

　　造血学参数的检测：C57bl/6J小鼠（10-10周龄的雄性）经眼眶后注射55μg/ kg G-CSF或1 mg/kg重组小鼠p-选择素，每天连续2天对待。*次注射后2天，使用自动血液分析仪测量造血参数。

　　结果：G-CSF可以使BM和脾脏的R4促红细胞生成能力超过EPO：G-in C57BL/6J小鼠持续3天以比较给药后G-CSF和EPO的促红细胞生成能力连续给药的CSF或EPO被注入尾静脉。通过流式细胞术分析了骨髓和脾中红细胞生成的进程。使用针对红细胞标记CD71和Ter119的抗体，将红细胞分为四组，以区分早期到晚期：原始红细胞（R1），嗜酸性粒细胞（R2），晚期嗜酸性粒细胞和多染色。性酸性红细胞（R3）和原色嗜酸性粒细胞（R4）。与其他研究结果一致，在小鼠骨髓中，G-CSF比EPO增强了非淋巴细胞群，而EPO显着增加了红细胞总数。 G-CSF治疗组小鼠骨髓中的红细胞总数低于EPO治疗组，但G-CSF诱导的R4群体明显高于EPO治疗组。脾脏是红细胞生成的次要器官，而不是粒细胞的产生。当解释小鼠脾脏分化的过程时，我们发现G-CSF处理不会增加非淋巴细胞或总红细胞的数量。与BM的作用相比，EPO上调了早期红细胞（R1和R2）的比例，下调了晚期红细胞（R3和R4），而G-CSF上调了早期R1和R2、晚期R4红细胞的数量显着降低了R2和R3细胞的比例。综上所述，这些结果表明G-CSF比EPO更能促进小鼠骨髓和脾的红细胞生成。

　　G-CSF比EPO动员新合成的网状红细胞：使用EGFP转基因小鼠模型，G-CSF比EPO动员新合成的红细胞至PB和红细胞发现外周血诱导它们高速进入。在采用相同的实验策略后，G-CSF处理后20小时，新合成的红细胞（R1）的动员效率显示出高于EPO处理。首次注入G-CSF和EPO后的招聘效率为40和60小时。相同。由于G-CSF比EPO更能促进BM和脾脏中R4红细胞的合成，因此我们假设G-CSF比EPO能够更促进网状红细胞的募集。在新合成的红细胞群中，只有网状红细胞显示残留的核糖核酸（RNA）表达，因此将RNA选择性染料F22与ter-119结合使用以在新合成的红细胞内与网状红细胞一起成熟。区分红细胞。在20和40个小时的两个阶段中，G-CSF倾向于动员比EPO更多的新合成的网状红细胞。不能通过诱导EPO和P-选择素途径来实现H-CSF依赖性的促红细胞生成和促红细胞生成：G-CSF上调转录因子HIF-1α和5个连续的G绑定到EPO启动子-CSF注射可增加循环EPO水平。我们假设G-CSF可以通过增加EPO合成来刺激红细胞生成和动员红细胞。炭疽芽孢杆菌（一种在小鼠中诱导缺氧并诱导EPO分泌的LT）用作阳性对照。与以前的研究一致，我们的结果显示，长期给予小鼠后，循环EPO水平逐渐增加。相反，在小鼠中进行G-CSF治疗后，所有检查均未发现循环EPO水平上调。结果表明，增强的G-CSF依赖的红细胞生成和红细胞募集不是由EPO诱导介导的。 P-选择蛋白被广泛认为是一种细胞粘附受体，通过与主要配体P-选择蛋白糖蛋白配体1（PSGL-1）的糖基化部分结合来调节白细胞滚动。由于p-选择素（hsc）-psgl-1（间质）的相互作用，与p-选择素相同的性质将hscS附着于基质细胞，尤其是滤泡内皮细胞。 G-CSF诱导PSGL-1基因敲除小鼠比野生型小鼠更快地动员更大的骨髓样细胞。研究还表明，施用G-CSF可增加循环可溶性P-选择素的水平。这些证据表明，P-选择蛋白/ PSGL-1介导的类红细胞祖细胞与基质细胞之间的结合部分调节了祖细胞的募集和从BM向血流G-CSF的释放。表示建议通过。它通过循环可溶性P-选择素和P-选择素/ PSGL-1诱导前体-基质相互作用，以促进红细胞募集。为了重现G-CSF介导的循环可溶性P-选择素的诱导，连续5天将G-CSF注入C57BL/6J小鼠。 G-CSF注射后，循环可溶性P-选择素水平显着增加。我们设计了一个实验来测试可溶性P-选择素是否可以增加外周血中的红细胞数量。两次服用G-CSF可增加外周血白细胞（WBC）和红细胞计数，但使用第二次服用可溶性P-选择素时未观察到相同的效果。该发现表明，G-CSF主要不通过P-选择蛋白途径将红细胞动员至外周血。

　　结论：G-CSF与EPO结合已用于治疗MDS，再生性贫血和HIV患者的贫血已有多年历史，但G-CSF促进红细胞生成的机制仍不清楚。这项研究表明，G-CSF促进红细胞生成，与EPO和可溶性P-选择素的分泌无关。另外，G-CSF诱导BM和脾脏而不是EPO产生R4红细胞。 G-CSF的治疗将新合成的网状红细胞吸收到PB而不是EPO。