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中洪博元,细胞实验
中国实验动物信息网
2020-07-20
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中洪博元作为多年在细胞培养实验拥有领先技术的生物技术公司，无论是理论研究还是实验操作上都有着丰富的经验，下面就大鼠胰岛细胞培养实验方法和步骤分享给大家，希望可以帮助有相关实验需求的朋友。
实验方法原理
水合氯醛腹腔麻醉，采用胶原酶ⅴ逆行灌注、原位消化及Ficoll-400梯度离心的方法分离、纯化大鼠胰岛，并分离、培养胰岛单细胞。
实验材料
一周龄Wistar 大鼠
试剂、试剂盒 D-Hanks’液 胰蛋白酶 Ⅴ型胶原酶 葡萄糖 碘乙酸
仪器、耗材 手术剪 手术钳 眼科剪刀 眼科镊子 大头针 手术刀片 培养皿
一、实验步骤
1. 一周龄Wistar大鼠，断颈处死，于75%乙醇浸泡15 分钟，无菌取出胰腺，于冰冷无菌D-Hanks’液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织，转入青霉素小瓶中。
2. 加入少量无菌D-Hanks’液，用眼科剪剪成0.1-1.0 mm3 大小的碎片，用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D-Hanks’液反复清洗 8~10 次，加入10 倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液：0.05 g 胰蛋白酶，0.025 g Ⅴ型胶原酶(663 U/mg)，0.05 g 葡萄糖，溶于100mL 无Ca2+、Mg2+的0.01 mol/L PBS(pH 值为 7.4)溶液，用0.22 µm 微孔滤膜滤菌]，38℃±1℃消化，消化过程中不断震荡，10 分钟后弃去上清液。
3. 用无菌D-Hanks’液将组织块清洗 2~3 次，加入新鲜酶液继续消化，重复上述步骤，此时组织块边缘模糊。
4. 将组织块浸入消化酶液中，38℃±1℃消化10 分钟，将消化酶液与组织块分开，组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化；而原消化酶液1500 rpm离心 10 分钟，取沉淀即为消化下的细胞，重新用无菌D-Hanks’悬浮，离心，重复 1~2 次，再用培养基洗 2~3 次，用培养基悬浮即得细胞悬液。
5. 将消化过的组织块重复消化5~6 次至组织块消化完全，重复以上操作。
6. 合并几次所得细胞悬液，计数，调整细胞浓度为 2×105个细胞/mL，将细胞悬液接种于24 孔塑料培养板中，每孔1 mL，置于37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。
7. 由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速，接种15 h 后，轻轻振荡培养板，将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中，可除去部分成纤维细胞。
8. 将新培养板中细胞培养 48 小时后，换新鲜配置的含有2.5 ng/mL 的碘乙酸的培养基培养5 h，可除去绝大部分成纤维细胞，而胰岛细胞不受伤害，换不含碘乙酸的培养基洗2 次，并换不含碘乙酸的培养基在 37℃、5% CO2，饱和湿度培养箱中培养，每隔 3 天换培养液，获得单层胰岛细胞。
实验方法原理
水合氯醛腹腔麻醉，采用胶原酶ⅴ逆行灌注、原位消化及Ficoll-400梯度离心的方法分离、纯化大鼠胰岛，并分离、培养胰岛单细胞。
实验材料
一周龄Wistar 大鼠
试剂、试剂盒 D-Hanks’液 胰蛋白酶 Ⅴ型胶原酶 葡萄糖 碘乙酸
仪器、耗材 手术剪 手术钳 眼科剪刀 眼科镊子 大头针 手术刀片 培养皿
一、实验步骤
1. 一周龄Wistar大鼠，断颈处死，于75%乙醇浸泡15 分钟，无菌取出胰腺，于冰冷无菌D-Hanks’液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织，转入青霉素小瓶中。
2. 加入少量无菌D-Hanks’液，用眼科剪剪成0.1-1.0 mm3 大小的碎片，用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D-Hanks’液反复清洗 8~10 次，加入10 倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液：0.05 g 胰蛋白酶，0.025 g Ⅴ型胶原酶(663 U/mg)，0.05 g 葡萄糖，溶于100mL 无Ca2+、Mg2+的0.01 mol/L PBS(pH 值为 7.4)溶液，用0.22 µm 微孔滤膜滤菌]，38℃±1℃消化，消化过程中不断震荡，10 分钟后弃去上清液。
3. 用无菌D-Hanks’液将组织块清洗 2~3 次，加入新鲜酶液继续消化，重复上述步骤，此时组织块边缘模糊。
4. 将组织块浸入消化酶液中，38℃±1℃消化10 分钟，将消化酶液与组织块分开，组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化；而原消化酶液1500 rpm离心 10 分钟，取沉淀即为消化下的细胞，重新用无菌D-Hanks’悬浮，离心，重复 1~2 次，再用培养基洗 2~3 次，用培养基悬浮即得细胞悬液。
5. 将消化过的组织块重复消化5~6 次至组织块消化完全，重复以上操作。
6. 合并几次所得细胞悬液，计数，调整细胞浓度为 2×105个细胞/mL，将细胞悬液接种于24 孔塑料培养板中，每孔1 mL，置于37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。
7. 由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速，接种15 h 后，轻轻振荡培养板，将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中，可除去部分成纤维细胞。
8. 将新培养板中细胞培养 48 小时后，换新鲜配置的含有2.5 ng/mL 的碘乙酸的培养基培养5 h，可除去绝大部分成纤维细胞，而胰岛细胞不受伤害，换不含碘乙酸的培养基洗2 次，并换不含碘乙酸的培养基在 37℃、5% CO2，饱和湿度培养箱中培养，每隔 3 天换培养液，获得单层胰岛细胞。