动物造模,脂肪组织,传染性SIV 中国实验动物信息网 2023-01-18 893

　　背景：记忆CD4T细胞和巨噬细胞是人类和HIV在非人类灵长类动物中的主要宿主和细胞库。感染免疫细胞的解剖学结构包括淋巴结（淋巴结、脾、胸腺、骨髓和GALT）和非淋巴组织（肺、皮肤、肝脏、肾脏、生殖和神经系统）组织。抗逆转录病毒疗法（ART）在大多数患者中降低全身病毒载量低于临床检测的检测极限，但如果ART中断，病毒复制通常恢复。由于某些独特的细胞障碍，ART在某些位置如CNS组织和淋巴结也不完全有效。因此，了解HIV的细胞和解剖储层，以及它们如何阻止ART药物的足够组织渗透，对于实现治疗是至关重要的。迄今为止，在HIV发病机制中被忽视的一个主要器官是脂肪组织。众所周知，一系列免疫细胞驻留或迁移到脂肪组织中并影响它们的代谢信号，但脂肪细胞和其他脂肪组织驻留细胞与CD4T细胞和巨噬细胞相互作用，这对HIV发病具有重要意义。解剖学上，脂肪组织主要位于皮肤（皮下脂肪）下面并围绕腹部器官（内脏脂肪）。然而，脂肪细胞也与大多数淋巴组织密切相关，淋巴结被脂肪组织紧紧包裹，脂肪细胞在骨髓中丰富，成年期胸腺逐渐充满脂肪细胞。这种复杂的排列在感染或免疫反应中是重要的，因为脂肪细胞是能量的主要来源和免疫细胞的存活信号。在细胞水平上，脂肪组织是异质的，由成熟的脂肪细胞（含有脂滴和甘油三酯的主要部分）和基质血管部分（AT-SVF）组成，主要包括前脂肪细胞（脂肪细胞前体）和成纤维细胞，间充质干细胞CE。LLS（MSC）、内皮细胞和免疫细胞。在人类和小鼠中的广泛研究表明，在正常情况下，脂肪组织内几乎每种固有的和适应性的白细胞都存在，其组成和功能随疾病和炎症的变化而显著改变。重要的是，对于HIV感染，脂肪组织驻留的CD4T细胞，其主要是活化的记忆性CD4T细胞（CD45 RO+CD69 + HLA+DR+CD25+），表型类似于HIV持续存在于其他组织中的那些。*近，我们首次证实了病毒抑制的ART治疗患者间质血管部分中存在的记忆CD4T细胞和HIV前病毒DNA的存在。此外，我们通过体外共培养实验表明，原代人脂肪细胞增强了CD4T细胞中的HIV复制。由于脂肪细胞是广泛存在的内分泌细胞，广泛调节免疫和疾病，这些研究结果需要进一步研究脂肪组织在HIV复制和持久性中的作用。

　　SIV感染恒河猴仍是HIV感染和病毒发病机制的*佳动物模型。本研究从恒河猴尸体上采集脂肪组织标本，用SHIV-SVF162P3感染4周（n＝8），或SIVMAC251感染38周（n＝8），不使用抗逆转录病毒药物治疗。我们假设脂肪组织中的记忆CD4T细胞含有传染性病毒，并且这些未经处理的感染的恒河猴会产生类似于HIV感染的人类的代谢并发症。虽然这些感染的猴的*初目的不包括脂肪组织的研究，但对脂肪组织的检查表明，感染感染性病毒的CD4T细胞浸润脂肪组织是SIV感染过程中的一种规律性事件。长期感染猴也产生一些类似于HIV患者的代谢异常。本研究结果强调了病毒在脂肪组织中的流行和稳定性，并为病毒引起的代谢功能障碍提供了新的证据。

　　结果：初次感染时脂肪组织中记忆CD4T细胞和SIV库的建立。病毒根除受到SIV在淋巴组织（7天内）传播的快速和猕猴感染后3天内建立的稳定SIV库的挑战，脂肪组织炎症和功能障碍通常涉及许多先天性和适应性免疫细胞的积累和调节活性，特别是促炎性记忆T细胞、巨噬细胞和NKT细胞。原发性感染还包括脂肪组织中病毒的播散和建立，因为脂肪细胞与大多数淋巴组织是错综复杂的。为研究初次感染时脂肪组织中白细胞和前病毒的分布，首次研究了急性感染（SHIV-SVF162P3）猕猴的脂肪组织样本。图1显示九只恒河猴直肠内感染后的血浆病毒载量，其中一只恒河猴感染不成功。恒河猴在感染后4周坏死，从腹部皮下和内脏部位采集到5～15克脂肪组织样本。AT-SVF细胞从脂肪组织中分离。用流式细胞术检测内脏AT-SVF细胞对活化记忆T细胞（CD3、CD4、CD8、CD95、CD25和CD69）、NKT细胞（CD3、CD16、CD27、CD56、GRZA和GRZB）、B细胞（CD19和CD80）和巨噬细胞（CD14和HLA.DR）的影响。未感染的健康猴中CD3+T细胞占9.8%，SHIV感染的猴占6.1%，慢性肠炎患者未感染的猴占15.3%。此外，在未感染的健康猴的AT-SVF中CD8和CD4 T细胞水平相似, AT-SNF CD8和CD4T细胞的比例在感染和疾病期间增加。对于未感染的健康和SHIV感染的恒河猴，几乎所有的AT-SVF CD4和CD8T细胞都是记忆性T细胞（＞94% CD95 +），其表达组织驻留和激活标记（62 - 84% CD69 +和3 - 13% CD25+）。然而，CD4T细胞比CD8T细胞（3 - 4%）表达高CD25（12 - 13%），可能指示Treg亚群。

　　脂肪组织CD4T细胞感染传染性SIV：为了评估SIV感染的CD4T细胞在脂肪组织中的感染性，我们对慢性SIVMAC251感染猴的AT-SVF纯化的CD4T细胞进行病毒生长试验（感染38周）。从外周血或AT-SVF细胞纯化的CD4T细胞连续稀释六倍，用PHA+IL-2激活2天，然后加入M8166细胞诱导诱导的SIV（由细胞外P27测定）。对于五只感染的猴，从外周血CD4T细胞中诱导病毒平行于AT-SvF CD4T细胞，对于两只感染的猴，外周血是不可用的，并且仅从AT-SvF CD4T细胞中检测病毒诱导。在研究的七只恒河猴中，传染性SIV是由AT-SvF CD4T细胞诱导的。以五只猴为基础，3～4周的外周血和AT-SVF F CD4 T细胞的感染率基本上是相同的，我们还评估了感染性病毒是否可以被分离的脂肪组织中的脂肪细胞中的成熟脂肪细胞隔离或捕获，因为有人认为HIV可能不产生感染脂肪细胞。从三只感染猴中，将6×106 M8166细胞在37°C下旋转，在5～8毫升内脏漂浮组分悬浮液中，每只恒河猴悬浮8小时，然后离心、洗涤，并用密度梯度离心法去除死亡的M8166细胞。然后培养3×106 M8166细胞，持续3周，测定细胞外P27，其中未检测到p27，表明缺乏感染性病毒颗粒的隔离或脂肪细胞捕获。为了进一步评估脂肪组织CD8T细胞的功能，尝试使用三个SHIV感染的恒河猴的总AT-SVF细胞来检测病毒生长试验。SIV感染恒河猴脂肪组织中的CD4T细胞复制能力和感染性受影响，但在脂肪组织CD8T细胞的存在下不会发生这种病毒诱导性。

　　缺乏抗逆转录病毒药物时SIV感染诱导代谢紊乱: 代谢障碍（如血脂异常，高脂血症，瘦素和脂联素产生减少）和脂肪细胞异常（如由于关键脂肪生成转录因子钝化表达而导致的分化阻滞）在HIV感染期间是普遍存在的。虽然这些缺陷中的一些被归因于ART药物的不利影响，但类似的并发症也发生在未治疗HIV患者中。此外，病毒蛋白如Vpr、NEF和TAT直接影响脂肪细胞功能。为了确定SIV感染是否诱导恒河猴的脂肪代谢缺陷，我们研究了C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ2、瘦素、脂联素和GLUT4的内脏脂肪细胞mRNA表达，以及血清总胆固醇、脂质（甘油三酯和游离脂肪酸）、瘦素和脂联素。当脂肪细胞广泛与T细胞相互作用时，我们还研究了调节T细胞刺激、存活和迁移的因子（IL-2、IL-7、IL-15/IL-15Rα、IL-6、TNFα、CCl 2、CCl 5、CC19、CL21）的脂肪细胞表达。对于脂肪细胞mRNA分析，从三个未感染的健康恒河猴获得内脏脂肪组织，与三个急性感染和五个慢性感染猴比较。与未感染的猴相比，感染猴脂肪细胞中PPARγ2、C/EBPα、C/EBPβ、瘦素和GLUT4存在差异表达。与未感染的恒河猴相比，急性感染的PPARγ2表达增加了30.2倍，慢性感染猴的PARRγ表达增加了3倍，而C／EBPα对急性感染减少了2.9倍，对慢性感染的恒河猴则减少了2.5倍，C/EBPβ在慢性感染中减少了4.3倍。感染猴，瘦素下降4.5倍，急性感染和3.1倍的慢性感染猴，GLUT4对急性感染患者下降4.1倍，慢性感染猴下降2.6倍。脂肪细胞中脂联素的表达在未感染和感染的恒河猴之间是相似的。与未表达的脂肪细胞因子结合，未感染和感染的恒河猴的脂肪细胞也表达了重要的免疫调节因子。与未感染的猴相比，感染猴的脂肪细胞表达IL-2、IL-7和CCR19增加1.6～3倍，而其他细胞因子和趋化因子的表达在未感染和感染的恒河猴之间是相似的，这表明脂肪细胞表达的因子可能有助于感染的CD4T细胞在脂肪组织中的存储和存活。

　　结论：在本研究中，感染SIV猴的脂肪组织被证明含有丰富的记忆CD4T细胞、高度感染性病毒和促炎性免疫细胞。SIV感染在没有抗逆转录病毒药物的情况下引起代谢并发症，其中一些类似于HIV患者的代谢状况。