动物造模,面神经损伤,药效评价 中国实验动物信息网 2024-10-29 969

　　背景：面神经肌肉疾病和面部神经损伤造成的功能损害是常见且严重的。审美缺陷也给患者带来痛苦，导致社会孤立和进一步的情绪困扰。这些都会导致抑郁症状和心理健康问题，从而进一步加重他们的功能障碍。有几个临床因素已被确定，进一步影响恢复周围神经功能后的神经损伤，包括修复时间，修复类型和患者的年龄。尽管显微外科技术取得了进展，但面神经损伤后功能恢复仍不理想。联带运动，近端残端轴突再生为不适当的远端通路，一直被认为是功能恢复差的一个重要因素。先前的研究已经表明，电刺激影响神经元的形态和功能特性，包括神经分支、轴突生长的速度和方向、快速出芽和轴突再生过程。有人推测，BES的作用机制是诱导运动轴突在感觉轴突上优先再支配，从而改善整体功能。2000，戈登等人研究电刺激对大鼠坐骨神经切断后神经再生的影响。作者通过fluororuby（FR）和荧光金（FG）逆行标记坐骨神经运动神经元，电刺激显著加速轴突再生以及优先重新支配的运动神经感觉支。作者还发现，短期的、1小时的刺激和持续几天到几周的长期刺激一样有效。从那时起，短暂的电刺激诱导运动轴突在感觉轴突上的优先再支配的概念得到了广泛的研究，现在已经确立。然而，BES减少特定的运动神经元轴突络随机扩展到不合适的远端运动轴突分支如面神经的联动效应，尚不清楚。*近，研究周围神经损伤和再生的研究小组对此问题提供了一些见解。通过利用外源性神经营养因子中和抗体，包括脑源性神经营养因子（BDNF）和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF），可以使面神经再生轴突的异常和冗余分支转化为不适当的通路。此外，一个单独的研究组证明BES能够调节运动神经元中BDNF的表达。因此，BES可能的作用机制可能是通过调节运动神经元中BDNF的表达来减少周围神经损伤后再生轴突的异常分支。关于面神经的损伤和再生，可能意味着减少联带运动。2005年， brushart等人表明，BES能够通过切断背根神经节感觉神经元促进感觉通路特定的神经支配。目前已经有几个研究证实BES提高面神经损伤后的联动效果。本研究的主要目的是测试BES减少面瘫面神经损伤的假设。第二个目的是观察BES对损伤后面神经功能的影响。

　　方法：实验设计：二十四只大鼠随机分为四组，每组六只。第1组和第2组在主干神经受到挤压伤，第2组另外接受BES 1小时。第3组和第4组在主干进行横断损伤，第4组另外接受BES 1小时。为探讨BES对联带运动的影响，对所有的受伤后3个月的动物面神经的上部和下部主要分支使用两种神经示踪剂进行标记。所有动物的脑干切片，以确定两个主要分支的运动神经元。比较了控制运动神经元标记的脑干。为了评估BES对功能的影响，术后2, 4周和6周收集面神经功能评估结果。使用先前验证的大鼠面神经模型。

　　研究对象：实验选用24只，体重为200～220克，雌性wistar大鼠作为研究对象。另外2只雌性wistar大鼠作为对照。样本大小是根据我们以前的研究计算的。

　　面神经功能结果评价：该模型采用头部固定装置、身体固定和双边光电传感器检测精确的触须运动，作为面神经功能的客观测量方法。建立评估模型，并使用门德兹等人概述的方法获得数据。

　　数据获取：对每个受试者，通过提供有香味的刺激引起触须运动。激光千分尺本身连接到一个32通道数字I/O模块，该模块接收激光千分尺的数字输出。I/O模块是通过压缩DAQ机箱连接到PC。I/O模块以1千赫的采样速率获得激光测微信号。

　　外科手术：所有非受试动物在同一麻醉期间接受一个外科医生的头部植入手术和面神经手术。另外2组和4组神经损伤后麻醉期间接受1小时BES。所有大鼠用3 - 4%异氟婉诱导麻醉。然后用1.5%异氟烷维持全身麻醉。用电动剃须刀从面部的正面和头顶去除毛发。

　　面神经手术：所有面部神经手术均在所有非对照动物的面部右侧完成一个小切口，刚好低于右耳骨性突出。在显微镜下可见腮腺。外翻查看手术视野。面神经远端支低于腮腺床。确定面神经颊支和下颌缘支的分支。一旦确定，面部神经分叉的近区被仔细解剖。第1组和第2组神经接受挤压伤。止血仪应用于面神经近端分支夹一段30秒。第3组和第4组接受神经横断损伤。用直显微镜剪对分叉近端面神经进行单一、锐利的横切；切断神经末端立即用直接端到端技术修复。使用9-0缝线，在近端和远端神经外膜神经末梢做四个简单的间断缝合。为确保适当的神经排列而采取了护理措施。

　　短暂的电刺激（BES）：随着面部神经受伤，第2组和第4组的动物接受了短暂的电刺激。刺激的操作是改编自戈登等人对坐骨神经大鼠模型刺激的使用。两个涂有聚四氟乙烯涂层的电线裸露在外面2 - 3毫米。神经修复后，*根钢丝绕着面神经近端残端环绕。第二根导线嵌入到邻近神经的肌肉组织中，位于*导线的近端处。绝缘导线连接一isostim刺激器，它以100微秒的脉冲传送1.5毫安电流，20hz连续一小时。动物右耳扑动证实了刺激的充分性。在刺激后，电线从动物身上取下来，并缝合伤口。

　　头部植入手术：面部神经手术后，在麻醉状态下完成头部植入手术。沿头盖骨用15刀片的手术刀从前到后边做一个小切口。钝性剥离充分显露下骨颅骨。使用电钻，颅骨的每一个象限都鉆4个洞，相距约15毫米。然后在每个钻孔位置放置1.6毫米螺钉。然后将干丙烯酸树脂液化并放置在头盖骨上，覆盖放置的螺钉。然后在树脂凝固前将两个较大的5毫米螺纹螺钉倒在螺纹上。

　　头和身体固定：手术前两周，所有动物受试者每天接受训练。手术后所有实验动物身体固定一周。在术后第14天，开始测量触须。受试动物*初被给予小剂量异氟烷并运送到身体约束装置。他们用螺钉穿过暴露的螺纹螺钉进行头部固定。触须标记，然后放置在任何一侧的老鼠的脸上。一旦完成，引入一个有香味的刺激持续5min。以非手术左侧为对照。每只大鼠分别于术后2、四、6周完成此步骤。

　　逆行标记神经元: 术后3个月，再次仔细解剖和辨认面神经颊侧和边缘下颌支。术后3个月的时间轴被选定为完全神经轴索再生，估计在伤后10周发生再生。颊部和下颌缘支被急剧切断，5毫米的分岔。每一枝通过逆行神经示踪剂，识别运动神经元支配的每一部分。每个神经示踪剂首先被放置在一小块明胶海绵。明胶海绵同神经断端接触1小时。各神经分支被大量地用生理盐水冲洗。注意防止交叉标记。每个神经示踪剂在脑干时间长达4天允许其到达运动神经元。

　　心脏灌注组织固定术：动物首先腹腔注射氯胺酮。腹腔切开后露出胸部，心室和升，降主动脉。使用18号导管，左心室被穿透，插进导管，直到见到升主动脉尖端。然后300ml的1M PBS通过导管灌注。再输注400 ml PBS，*后经导管注入4%多聚甲醛。动物安乐死后，暴露大脑并取出。大脑样品置于4%多聚甲醛，然后切换到30%蔗糖24小时。组织-70度冷却后，储存于-80度冰箱。

　　运动神经元计数：冷冻组织标本已从储藏室取出，冷冻切片20微米厚，切片固定于玻片上并干燥。分段切片后用荧光显微镜观察。所有的运动神经元标记只有FR（红色），只有FG（蓝色），或两者都有。用阿伯克龙比法校正分裂细胞并计数。

　　结果：所有动物均耐受手术，无围手术期并发症。他们表现出正常的笼行为，并没有减少体重。

　　功能结果的测量：所有实验动物经历了术后同侧振动幅度完全丧失。第二周，第1组（挤压，无刺激）的平均振幅为14.4度。与第1组相比，第2组在术后2周平均振幅为24度。3组（横断，无刺激）和4（横断，BES）平均挥动的振幅为4.8和14.6度，分别有统计学意义。第四周，第1组表现出*小的振幅损失，平均为11.6度，而第2组从第2周起振幅相对保持不变，平均为23.2度。第3组和第4组在第四周的平均振幅分别为9.1度和13度。1组在手术后第6周平均幅度为20.3度。第2组的平均振幅为26.7度。组1和2在面神经手术后6周内差异无统计学意义。组3和4,在第6周时显示相似的振幅。在损伤4周后，BES显著提高受挤压伤动物的挥动能力。横断神经两周后，BES显著提高挥动能力。

　　逆行标记神经元：在对照组动物，FR（颊支）标记平均1388的神经元进，而FG（下颌缘）标记平均310的神经元。对照组动物没有观察到双重标记的动物。组1和2分别有平均989（49%）和934（46%）双重标记的运动神经元。组3和4分别有平均1299（68%）和1222（62%）双标记的神经元，动物接受BES（组2和4），减少面神经损伤后平均双标神经元。总的来说，相比组3和组4，BES显著减少组1和组2双标神经元。

　　结论：研究表明，短暂的电刺激大鼠面神经挤压伤模型与加速面神经功能结果有关。BES也可诱导面神经损伤后运动神经元的特异性再生。这对人类面神经损伤有重要的临床意义和潜在的应用价值。