动物实验 中国实验动物信息网 2020-09-05 895

　　背景：角膜疾病和损伤都会损害角膜，*终导致失明。角膜损伤的主要治疗方法是角膜移植。然而，两个主要问题制约了移植的临床应用。这些并发症包括严重的术后并发症，导致移植物排斥和供体角膜供应不足。上世纪80年代，穿透性角膜移植术（PKP）是主要的移植手术。术后免疫排斥反应是一个严重的并发症，遵循PKP，可导致移植物内皮功能障碍和长期生存率降低。移植后第1, 3, 5和10年成活率分别为84%、69.3、60.7%、和59%。移植失败的*常见原因是免疫排斥反应。其次是迟发性内皮功能衰竭和眼表并发症，占所有失败病例的74%以上。而近年来，在角膜疾病不涉及内皮细胞的情况下，产生良好临床效果的薄片技术迅速取代了穿透性移植物。这项技术的目的是选择性地替换患病的角膜基质组织，以尽量减少不必要的替代健康的内皮层。板层角膜移植术（LK）是困难和费时的，2.3-3.5%的病例需要转换成PKP。然而，类似于视觉穿透性角膜移植术，其他限制因素还包括角膜表面变形，是由缝合张力和移植物宿主界面的差异造成的。接受飞秒激光辅助的镶嵌自体或异体移植后，恒河猴没有遭受角膜排斥反应。此外，角膜板层镶嵌模型避免刺激眼球表面和内皮细胞，并在一定程度上延长移植物存活率。此外，飞秒激光切割是一种高精度、安全和可预测的技术，是角膜屈光手术和角膜移植的新选择。飞秒激光切割总能在角膜基质内的每个部位达到一致的深度和厚度，并且精确地匹配供体和受体组织。与普通的激光切割相比，飞秒激光切割提供了*大的优势，因为它允许高水平的控制，大大减少了手术的侵袭力。角膜移植的另一个临床困难是供体不足。异种供者的应用可能有助于缓解供体角膜的不足，因为角膜的独特特性与其他组织和器官相比。。近年来的研究表明，低抗原性的移植物可以作为角膜组织再生的支撑材料。甘油脱水已经显示出细胞和供体角膜的抗原性大大减少，特别是在基质。因此，甘油脱水角膜片可能为嵌体异种移植物提供一种可能的替代来源。这是目前一个新兴的研究领域。我们开发了一种新的小切口飞秒激光辅助外科手术，以减少外科手术的侵袭力，提高移植和供者组织的匹配能力。我们利用飞秒激光辅助手术形成嵌体移植物，并在甘油中脱水异种移植物，以减少它们的抗原性。本研究旨在在恒河猴角膜中植入异种角膜片和新鲜异体片层后，进行小切口飞秒激光辅助手术的生物相容性评价。我们还评估了甘油脱水角膜板层作为角膜嵌体的生物相容性。

　　方法：研究设计：用飞秒激光辅助手术从三种动物（人、兔、猴）中获得了角膜板层。两种类型异种移植物（人和兔子）用甘油脱水1周。所有移植嵌入猕猴角膜小切口基质透镜取出术使用辅助外科手术。四只猴子接受新鲜异体移植作为对照组。另4只猴子接受人类甘油保存移植片，称为“人猴组（H- M组）。另4只猴接受兔甘油保存移植片称为兔猴组（R-M组）。手术结束后，我们每天观察猴子的眼睛外观，并对移植后1周、1, 3个月和6个月的12只猴子进行了检查。

　　动物：本研究选用5只成年新西兰白兔和16只5岁恒河猴。这些动物被单独安置，并在整个研究过程中免费获得食物和水。

　　恒河猴同种异体移植：实验时4只猕猴选择使用舒泰50肌肉注射（5毫克/公斤）麻醉，使用飞秒激光小切口基质透镜取出术（SMILE）随机选择一眼进行屈光度−4近视治疗矫正。飞秒激光参数设置如下：135nJ，120μM帽厚度和直径7.5毫米的帽。在140°位置侧切口角度为90°的小切口（3 mm）。分离角膜板层（81—μm）作为新鲜同种异体移植。

　　人角膜板层移植：从接受SMILE手术的10人收集10个移植片，患者的等效球镜为6−9 D. 所有患者均书面同意参加本研究。所有外科手术都是由一位外科医生完成的。飞秒激光参数如下：135 nJ，120μM帽厚度和直径7.5毫米的帽。通过切口提取人角膜板层（2.5mm）。角膜片被无菌甘油浸泡，4℃脱水1周。此外，它们可以被用作人体角膜片层移植片。

　　兔角膜板层移植：用过量麻醉药（舒泰50，Virbac，50毫克/公斤，肌肉注射）处死动物。利用飞秒激光辅助治疗制作兔角膜板层切口。一个小的曲面界面锥位于角膜中心。手术参数如下：切口直径7.5 mm，切口位于320μm深度处，侧切角度为90°。接下来进行了准分子激光屈光性角膜切削术实现了−4 D近视。然后我们将角膜片与基质床分开。角膜片层在无菌甘油中浸泡，在4°C脱水1周后用作兔角膜片层移植片。

　　飞秒激光辅助角膜移植：12只猕猴麻醉使用舒泰50肌肉注射（5mg/kg）. 然后,接受SMILE手术在一个随机选择的眼睛实现了一个−0.75D治疗近视的矫正. 采用飞秒激光参数：135 nJ，160μM帽的厚度，帽的直径7.8-mm，和板层角膜直径7.8-mm。在140°位置做了一个小切口，切口角度为90°。微透镜（28μm厚）是分开的，产生一个类似“基质袋”的空间。移植物植入于基质袋中。在植入过程中，我们避免了移植物表面的翻转。手术后，所有的猴都接受妥布霉素地塞米松滴眼液每日4次连续1周。每天观察猴的眼睛外观，检查了移植后1周和移植后1, 3周和6个月的12只猴眼情况。

　　临床检查：术后进行裂隙灯检查以评估植入物颜色、周围角膜上皮透明性、新生血管、角膜水肿、排斥反应和植入物降解的变化。眼的眼前段的特性，包括角膜厚度，采用眼前段光学相干断层扫描仪（OCT）评估。恒河猴供体角膜中央厚度约为450μm，采用了80μm的移植片厚度来达到接近250μm的剩余基质厚度（RST），以稳定猴的眼内压。在同种异体移植组，预测变化值为81–28 = 53μM。

　　泪液收集和炎症介质测定：非刺激性泪液样本使用一次性10 - l吸管收集。在下缘区、结膜或睑缘处进行泪液收集。使用试剂盒测定眼泪中的IL-1β、IL-6、IL-17、TGF-β1、TNF-α和IFN-γ。

　　结果：角膜板层的物理特性：大体观察显示，甘油脱水后所有角膜片层都保持透明。

　　临床观察：在6个月的观察期内，所有猕猴在异体移植组和移植组两存活无感染或出血性并发症。术后6个月内，无明显眼睑痉挛，结膜发红增多，角膜新生血管，移植物退化迹象，前房无任何可察觉的反应。宿主角膜组织保持透明。

　　OCT观察：各组角膜移植术后角膜基质清晰可见。在6个月观察期内，移植物在“基质袋”内保持稳定。术后1周角膜厚度增加，术后1个月角膜厚度无明显改变。

　　眼泪炎症介质：测定术后的炎症介质值与术前比较。所有的泪液炎症介质在“兔-猴”组有显著改变。“人-猴”组泪液介质的变化趋势与“兔-猴”组相似。术后1个月炎症介质水平低，IL-1β, TGF-β1和 IFN-γ除外。

　　结论：研究表明甘油脱水角膜移植保持透明。手术后，所有的猴存活，没有植入排斥或任何不良并发症。同种异体移植和异种移植片保持透明和引起*小的炎症反应。此外，嵌体片与宿主组织相匹配稳定。甘油脱水角膜片作为替代嵌体异种材料具有潜在的应用前景。此外，飞秒激光辅助角膜移植有*小的侵袭并能提高手术效率。宿主角膜也保持高度的生物相容性。在本研究中，我们提供了一种新的治疗高度远视，老花眼，圆锥角膜，角膜膨隆，和其他疾病的新方法。我们还将进一步研究潜在异种免疫机制和植入后角膜屈光状态的变化，以期为将来的临床应用奠定基础。