PCR z-bio 2025-10-11 381

　　做实验时总被PCR、RT-PCR、qRT-PCR 绕晕？作为生物科研的 “入门必修课”，这三者的区别其实藏着清晰的逻辑线。今天不仅用大白话帮您一次区分到位，更结合最新技术突破和实操痛点，教您轻松避开那些年踩过的实验坑！

　　普通PCR：DNA 的 “复制复印机”，基础操作别大意

　　普通PCR 就像一台精准的 DNA 复印机，核心任务是将目标双链 DNA 片段大量扩增，让原本微量的片段变得 “可见可及”。其原理并不复杂：以双链 DNA 为模板，dNTP 为合成原料，在 Taq DNA 聚合酶的催化下，通过一对特异性的 F/R 引物 “定位” 目标片段，经过变性、退火、延伸的循环反应，实现片段的指数级复制。

　　1.核心应用场景

　　产物经琼脂糖凝胶电泳确认大小后，可用于目的基因克隆、病原体DNA 检测、突变分析等基础分子实验，是后续复杂实验的 “原料制备机”。

　　2.工具与实操避坑指南

　　引物设计：推荐用NCBI 网站确认靶序列，搭配 Primer Premier 软件设计。重点检查引物是否形成二聚体，两条引物的电泳条带亮度需大体一致，避免因浓度失衡导致扩增失败。

　　关键试剂把控：Taq 酶需分装保存防失活，Mg²⁺浓度是 “双刃剑”—— 过高降低特异性，过低直接影响产量，建议按梯度浓度预实验优化。

　　常见问题破解：无扩增条带先查模板（是否降解、含抑制剂），出现非特异条带可提高退火温度或减少循环次数，片状拖带多因酶量过多或dNTP 浓度过高导致。

　　RT-PCR：RNA 的 “身份转换器”，防降解是关键

　　如果研究对象是RNA（比如基因转录情况），普通 PCR 就无能为力了 —— 因为它无法直接以 RNA 为模板。这时就需要 RT-PCR 登场，它多了一步 “逆转录” 魔法，能先将 RNA 转化为稳定的 cDNA，再进行后续扩增。

　　1.核心流程

　　总RNA 提取→基因组 DNA 去除→逆转录合成 cDNA→PCR 扩增→凝胶检测。这一过程能精准反映基因的转录活性，常用于验证目的基因是否表达、确定启动子区间等。

　　2.RNA 操作 “生死线”

　　RNA 极易被 RNase 降解，操作全程需绷紧 “防污染弦”，结合实验技巧优化流程：

　　1）全程防降解：除用无酶耗材和RNase 清除剂处理台面外，Trizol 提取时需确保样本充分裂解，氯仿振荡要剧烈且迅速，避免 RNA 滞留有机相。

　　2）质量检测升级：电泳观察28S、18S、5S 三条带的同时，用紫外分光光度计测 OD 值 ——260/280 比值 1.8-2.0、260/230 比值大于 2，才算是合格 RNA。

　　3）对照设置不可少：必须加“无逆转录对照”（用未逆转录的 RNA 做模板扩增管家基因），确认基因组 DNA 已除净，否则结果全是假阳性。

　　qRT-PCR：精准 “剂量秤”，荧光追踪 + 定量升级

　　qRT-PCR（实时定量 PCR）是三者中 “精度最高” 的选手，不仅能扩增片段，还能通过荧光信号实时追踪扩增过程，最终实现靶序列的定量分析。2025 年广州实验室的技术突破，更让它从 “慢炖” 变成了 “爆炒”。

　　1.原理与技术新突破

　　常规qRT-PCR 需经 “RNA→cDNA→荧光定量扩增” 三步，核心是通过荧光信号强弱反映 DNA 合成量。而徐强教授团队研发的超快速 qRT-PCR 技术，将升降温速度提升至每秒 50-100 摄氏度，把原本 2 小时的扩增压缩到 12 分钟，全流程检测仅需 30 分钟，成本却与传统方法相当。

　　2.主流荧光检测方法

　　1）荧光染料法（以SYBR Green I 为代表）：染料可特异性嵌入双链 DNA 并发出强荧光，PCR 延伸阶段随双链 DNA 合成，荧光信号强度与双链 DNA 含量成正比。

　　2）荧光探针法（以TaqMan 为代表）：探针为靶向目的基因的寡核苷酸链，两端分别标记荧光报告基团与淬灭基团。探针完整时荧光被淬灭，扩增中 Taq 酶水解探针使两基团分离，释放荧光。仪器每循环检测一次荧光强度，形成扩增曲线，通过 Ct 值实现相对或绝对定量。

　　3.三大高频应用场景

　　1）肠道菌群定量：提取粪便基因组DNA，用 16S rRNA 可变区特异引物扩增，搭配超快速 qPCR 可实现样本快速筛查。可依据该菌16S rRNA 基因可变区设计特异引物（建议参考已发表文献的验证引物）。

　　2）小RNA 检测：miRNA 等小片段需用茎环引物法逆转录，优先选 TaqMan 探针法定量，LNA 修饰引物能进一步提升特异性。

　　3）环形RNA 分析：先用 RNase R 降解线性 RNA，设计跨 BSJ 的发散引物，内参选 18S rRNA（避免 GAPDH 等易降解分子）。

　　4.定量结果避坑要点

　　1）Ct 值异常排查：Ct 值过大可能是模板量不足，过小需警惕污染，建议设置阴性对照（无模板）和阳性对照（已知浓度标准品）。

　　2）数据标准化：相对定量需选稳定内参，绝对定量要制备标准曲线，避免因操作差异导致结果偏差。

　　三分钟分清三者：一张表搞定核心差异

　　科研人经验池：这些“暗坑” 我替你踩过了

　　引物储存：高浓度分装冻存，避免反复冻融，使用前需离心，防止附着管壁导致浓度不足。

　　RNA 溶解：75% 乙醇清洗后避免过度干燥，用 RNase-free 水 37℃孵育 10 分钟助溶解。

　　污染处理：扩增产物污染是假阳性主因，建议实验分区操作，移液器用滤芯吸头，定期用紫外线照射台面。

　　2025 年超快速 qPCR 技术的落地，让核酸检测进入 “分钟级” 时代，而扎实掌握基础操作仍是精准实验的根基。您在实验中遇到过哪些棘手问题？比如 qPCR 的 Ct 值波动、RNA 提取反复失败？欢迎在评论区分享，一起解锁更多避坑技巧！