1、复苏MEF饲养层细胞与复苏IPS细胞

　　在培养瓶中加入明胶，摇匀覆盖底面即可，放于37℃培养箱至少10-30min,吸除明胶（这步可省），加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液。将MEF饲养层细胞从冻存管中取出，37℃迅速溶解，用酒精擦洗冻存管外壁。将冻存管的细胞悬液额转移至2mLMEF完全培养液的离心管中，1000rpm离心4-6分钟，弃上清，加入1mLMEF完全培养液，多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液，加入到培养瓶中。

　　将IPSCs细胞冻存管迅速从液氮罐中取出，37℃迅速溶解，用酒精擦洗冻存管外壁。将冻存管的细胞悬液转移至5mL IPS细胞完全培养液的离心管中，1000rpm离心4-6分钟，弃上清，加入新鲜的IPS细胞完全培养液，多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液，转移至铺好MEF饲养层细胞的培养板中，置于37℃，5% CO2培养箱继续培养。

　　2、IPS细胞传代培养

　　吸除废液，用PBS轻轻冲洗一遍，加入1mL适宜浓度的胰蛋白酶（含EDTA）至培养瓶中，轻轻晃动，使胰蛋白酶覆盖底面，置于37℃消化细胞，消化1-3min，加入小鼠IPS细胞完全培养液终止消化，1000rpm离心4-6分钟，弃上清，加入1mL小鼠IPS细胞完全培养液，多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液，加入5mL的小鼠IPS细胞完全培养液吹打混匀，装入铺好MEF细胞的培养瓶中，5% CO2培养箱中继续培养，并在培养瓶上标明传代的次数及日期，每天换液。

　　3、EBS拟胚体的制备

　　用适宜浓度的胰酶消化细胞后,用不含MEF的小鼠胚胎干细胞培养液制成单细胞悬液，接种在 0.1%明胶预先包被的培养皿中 ，37℃孵育40-60min 去除 MEF （先贴）后，将上液移入培养板中培养24h，显微镜下观察及拍照。

　　结果展示